[发明专利]改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种编码β-葡萄糖苷酶基因及其重组质粒和构建方法，克隆、突变及其高效表达，涉及分子生物学、生物信息学、酶学以及基因工程等领域。具体涉及对原始黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造，以及重组酶的制备。

 

技术背景

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名纤维二糖酶、龙胆二糖酶和苦杏仁苷酶。是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为三类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。而根据β-葡萄糖苷酶的基因序列的不同，又可分为β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B之分。β-葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，但来源不同，其性质各异（J Biological Chemistry, 1996, 271(39): 23749-23755）。

β-葡萄糖苷酶在植物纤维原料制备燃料乙醇及食品工业中具有重要的应用。目前，影响木质纤维资源生物转化技术实用化的主要障碍之一就是纤维素降解酶的生产效率和使用效率都很低，从而导致纤维素酶的使用成本要占到酶糖化纤维材料总成本的25~50%。在用于制备生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，如木霉属、曲霉属、青霉属等，其中木霉特别是里氏木霉突变株产生的纤维素酶的活力较高、酶系较全、应用最为广泛。但木霉纤维素酶的高活力主要表现在含有高活力的内切型和外切型葡聚糖酶，而β-葡萄糖苷酶的活力明显。研究表明，天然纤维素的有效降解需要由纤维素酶系中内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶这三大主要组分充分发挥协同作用才能完成，仅用木霉纤维素酶降解时，纤维素二糖会大量积累在水解液中，并强烈反馈抑制内切型和外切型葡聚糖酶的催化活性。所以，低活力的β-葡萄糖苷酶是造成酶水解纤维资源得率低、酶用量大、成本高的关键因素之一。此外，β-葡萄糖苷酶可作为风味酶应用于（果）酒、茶叶、果汁中起到增香作用；可应用于乳品工业中分解乳糖；也可应用于催化葡萄糖发生转移反应和缩合反应合成功能性低聚糖等。因此，高活力、低成本的β-葡萄糖苷酶制备技术已成为国内外在这些领域中的研究热点（Phytochemistry, 1988, 27: 1973-1976）。

黑曲霉是β-葡萄糖苷酶的高产菌株。但是，通过营养条件和培养条件的优化，黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活力仍不能满足工业上的需要，而且成本较高。研究表明，对β-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高β-葡萄糖苷酶活力的最有效方法。到目前为止，在GenBank和DDJB数据库中已有两条黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列（bgl1和bgl2）被报道。国内外也有实现了β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中表达的研究报道，但均未进行高效表达的研究（J Biol Chem., 2000, 275: 4973-4980）。