[发明专利]一种猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物疫苗用的佐剂及制备方法，确切讲是一种猪用C型口 蹄疫基因工程疫苗佐剂及制备方法，更确切讲本发明是一种用于由C型口蹄疫 的VP1和VP3蛋白混合物构成的C型口蹄疫亚单位疫苗的佐剂，以及其制备方 法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是一种能够感染包括牛、羊、猪 等主要家畜在内的多种偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其 病原体为口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)。FMDV属于微 RNA科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，共包括7个血清型(A、 C、O、Asia I、SAT I、SAT II及SAT III)，各血清型之间无交叉保护力。

基因亚单位工程疫苗由于安全性好易于保存，效果理想等优点具有广阔的 前景。然而基因亚单位工程疫苗免疫原性相对较弱，为了更好地激发机体的免 疫系统，使其对口蹄疫病毒具有足够的抵抗力，多采用在疫苗中加入佐剂，例 如油佐剂。

发明内容

本发明提供一种用于C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗的佐剂。

本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂是重组猪α-干扰素。更确切讲， 本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂是剔除掉了干扰素的前端8个信号 肽的重组猪α-干扰素，其核苷酸序列为SEQ ID No3。

本发明所述的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法是：用经口蹄疫 病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方法获得猪α-IFN 基因，将所得到的猪α-IFN基因连接于原核表达载体上构成质粒，再转入原核 表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐剂。

作为最佳实施方式，本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法 是用经口蹄疫病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方 法获得猪α-IFN基因，将所得到的猪α-IFN基因连接于原核表达载体上构成质 粒，再转入原核表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐 剂。这里所用的复性处理中可采用不同浓度的尿素溶液，或者盐酸胍或者甲酸 溶液(如70％的的甲酸溶液)。在前述制备方法中所用的一对猪α-干扰素基因用 RT-PCR引物为：

IFN-正向引物：5′-GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3′

IFN-反向引物：5′-CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3′；。

所用的原核表达载体为pET-30a；所用的原核表达系统为大肠杆菌 BL21(DE3)。

本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法中优选的于产物复性 处理方法为采用含DDT和EDTA的盐酸胍溶液，其中盐酸胍的终浓度为1.5M， DDT的终浓度为1mM，EDTA的终浓度为10mM。

α-IFN是一种广谱抗病毒剂，虽然它不直接杀伤或抑制病毒，但却可以通过 细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增 强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调 节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要 是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上 具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 近年研究表明干扰素有利于CD8+记忆T细胞的生长作用，在病毒性疾病，如乙 肝、丙肝、水泡性口炎病毒等得治疗中被广泛应用。IFN-α家族由至少13个功 能性亚型组成，它们拥有同样的受体系统和相似的生物活性。研究发现它在先 天性免疫和适应性免疫方面具有许多重要的功能。作为口蹄疫疫苗佐剂的研究 最早见于Moraes(2003)的报道，国内研究见于2008年，是以干扰素全序列(含 有全部信号肽)与口蹄疫病毒VP1结构蛋白序列以及腺病毒载体共表达的活载 体疫苗(Veterinary Immunology and Immunopathology，124，2008：274-283)， 但安全性目前依然存在风险。