[发明专利]青虾MnSG基因、其扩增方法及扩增引物组

说明书

技术领域

本发明涉及基因克隆领域，特别涉及青虾MnSG基因、其扩增方法及扩增引物组。

 

背景技术

在真核生物中，受精是指两性生殖细胞的相互融合。受精包括精子获能，顶体反应，结合穿越透明带，和卵膜的相互融合等一系列复杂的生理过程。而精子表面的蛋白酶在这些过程中起着重要的调节作用。Honda等对老鼠的研究表明，老鼠的精子上存在一种具有水解明胶活性的蛋白酶，该蛋白酶被认为在精子穿越卵膜时发挥重要作用。Stambaugh等在兔子的研究中发现，兔精子顶体上一种胰蛋白酶是精子成功穿越卵膜所必需的。Kodama等对海鞘的研究表明，海鞘(Halocynthia roretzi)精子上的一种类胰蛋白酶spermosin，在海鞘精子穿越卵膜的过程中起了重要的协助作用。目前，关于甲壳类动物精子蛋白酶的研究非常有限， Li等对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的研究中发现，M. rosenbergii精子中一种明胶酶蛋白是雄性生殖道特有的，被认为可能参与受精过程。Rios等对正型动额虾(Rhynchocinetes typus)的研究表明，R. typus的精子提取物中，一种具有胰蛋白酶活性的蛋白被认为参与精子穿越卵膜的过程。

青虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水养殖经济品种。目前青虾的分子研究多集中在群体遗传多样性方面，其基因克隆研究较少，而对青虾精子蛋白酶相关基因克隆的研究尚未见报道。本研究拟以青虾为实验材料，根据本实验室青虾精巢cDNA文库中筛选到的一个青虾精子类明胶酶(Macrobrachium nipponense sperm gelatinase, MnSG)基因片段，通过RACE技术克隆出该基因全长cDNA序列，以期为后续青虾MnSG基因功能的研究奠定基础，同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。

  

发明内容

有鉴于此，本发明提供青虾MnSG基因、其扩增方法及扩增引物组。利用本发明提供的引物组从青虾精巢组织中克隆到了MnSG基因序列，对青虾MnSG基因功能的研究奠定基础，同时为甲壳类生殖研究积累背景资料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了青虾MnSG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了用于扩增青虾MnSG基因的引物组，其由如下引物组成：

引物组:

正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

正向内引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

反向内引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了一种扩增青虾MnSG基因的方法，包括如下步骤：

步骤1：获得青虾脑组织总RNA；

步骤2：合成cDNA；

步骤3：从本实验室构建的青虾精巢cDNA文库中筛选到MnSG基因片段，以此作为中间序列；

步骤4：用引物组扩增获得青虾MnSG基因片段的3’端和5’端片段；所述引物组由如下引物组成：

正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

正向内引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

反向内引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

步骤5：将所述MnSG基因cDNA序列的中间片段、所述MnSG基因的3’端和5’端片段拼接，即得。

作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。

本发明以青虾精巢组织为材料，分离了青虾MnSG基因全长cDNA序列，利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、嵌套聚合酶链反应（Nested-PCR）、3’端cDNA快速扩增（3’-RACE）以及5’端cDNA快速扩增（5’-RACE）的方法，对青虾MnSG基因进行了研究，首次从青虾精巢组织中克隆到了MnSG基因全长cDNA序列，并对其所编码的MnSG的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究青虾MnSG基因的表达、功能研究奠定了基础，同时也为甲壳类生殖研究提供了新的材料。