[发明专利]高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

权利要求书

1.高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于利用二氢叶酸 还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5 的细胞株，具体方法按以下步骤进行：

一、目的片段双酶切：由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T 载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片 段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；

二、质粒载体双酶切：用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C， 反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；

三、DNA片段的连接，反应体系如下：

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5；

四、细胞培养：用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养二氢叶 酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-；

五、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5与质粒 pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中进 行转染，细胞达到95％融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μL/ 孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴 定阳性转染的细胞按1∶10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14～16d后有 阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；

六、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L 和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株， 即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

2.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其 特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其 特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO： 2所示。

4.权利要求1所述高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物 的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。