[发明专利]高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及高效分泌表达AcAP5的CHO细胞株。

背景技术

犬钩虫吸血时，其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，被称作犬钩虫抗凝血肽 (anticoagulant peptide，AcAPs)。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶 原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前已有AcAP5、 AcAP6、AcAPc2三种重组蛋白。AcAP5由77个氨基酸组成，是Xa因子的高效特异性 抑制剂，与Xa的反应位区在肽37-42(-C-R-S-R-G-C-)，作用位点在第40位 精氨酸和第41位甘氨酸之间。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用有将会成为临床上一种新的 抗凝剂和抗血栓治疗药物。

目前用CHO表达AcAP5的最高表达量是6mg/L，且无法满足工业化生产。

发明内容

本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产 的问题，提供高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

本发明高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶 缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr^-)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效 表达AcAP5的细胞株，表达量最高达到12mg/L·72h。

本发明高分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的构建方法，按以下步骤 进行：

一、目的片段双酶切：由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T 载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，目的片 段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；

二、质粒载体双酶切：用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C， 反应体系如下：

酶切反应条件为37℃放置3小时，然后将酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，再用 DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；

三、DNA片段的连接，反应体系如下：

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5；

四、细胞培养：用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养二氢 叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr^-；

五、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-AcAP5与质粒 pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000Reagent共转染CHO-dhfr^-细胞，在24孔板中 进行转染，细胞达到95％融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II， 500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA 试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1∶10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14～ 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔 板，经ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；

六、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8mmol/L、1×10^-7mmol/L 和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株， 即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。