[发明专利]荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒及其应用

权利要求书

1.用于miR-21荧光定量检测的PCR引物，其包括：

miR-21逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACTCAACAT

miR-21PCR引物：

上游引物：CGCGGTAGCTTATCAGACTGATG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG。

2.如权利要求1所述的PCR引物，其还包括作为内参检测的miR-16PCR引物：

miR-16逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCGCCAAT

上游引物：GCGGTAGCAGCACGTAAATATTGG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG。

3.含有权利要求1或2所述引物的实时荧光定量PCR试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其还包括选自以下试剂中的一种或多种：

(1)Trizol试剂；

(2)逆转录试剂；

(3)PCR扩增试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，

Trizol试剂包括：重蒸苯酚200mL；8-羟基喹啉0.2g；二硫苏糖醇0.5g；异硫氢酸胍100g；蒸馏水118mL；0.75M柠檬酸钠7.04mL；10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL；2M醋酸钠20mL，调pH至3.2-5.6。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂 包括：逆转录酶、逆转录缓冲液、DTT、dNTPs、RNAsin；

优选所述逆转录试剂包括：50～400U/μL M-MLV；4～6×逆转录缓冲液；0.8～1.2mol/L DTT；8～12mmol/L dNTPs；35～45U/μL RNAsin，所述逆转录引物溶于逆转录试剂中浓度为100～2000nmol/L。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR扩增试剂10μL；PCR上下游引物各1μL。

8.权利要求1或2所述的引物或权利要求3～7任一项所述的试剂盒在检测血清miR-21中的应用。

9.一种检测血清标本中miR-21的方法，包括步骤：

(1)血清标本中总RNA的提取；

(2)用权利要求的3～7所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中步骤(2)包括RNA的逆转录和PCR扩增，所述逆转录的反应条件为：16℃退火30min，37℃逆转录30min，85℃灭活逆转酶5min；所述PCR扩增的反应条件为：95℃8～12min；95℃13～17s，58～65℃1min，40～50个循环；60℃～95℃绘制熔解曲线；优选95℃10min；95℃15s，62℃1min，45个循环。