[发明专利]荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种血清miR-21检测试剂盒及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术

miRNA是一类长度为19～24个核苷酸(nt)的内源性非编码小分子单链RNA，在进化过程中高度保守，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起mRNA的降解或者抑制其翻译，而广泛地负调控靶基因的表达。大量实验证明miRNA在干细胞维持、细胞分化、增殖、凋亡、代谢、胚胎发育、免疫应答及肿瘤的发生发展等生命活动中发挥重要作用。近几年，miRNA被视为新一代肿瘤标志，其在肿瘤诊断，预后中起非常重要的作用。

miR-21被视为一种癌基因，在神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的组织中上调表达。其的主要通过作用于抑癌基因PTEN及肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)，而促进肿瘤的发生发展。另有报道它也能直接作用于程序性细胞死亡因子4(PDCD4)与乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)而介导肿瘤的转移与侵袭。对于miRNA在肿瘤分子生物学的基础研究固然重要，若能在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并用于肿瘤的早诊及预后则更具有意义。最近有报道血清miR-21作为肿瘤标志物，对乳腺癌的诊断和预后及监测有比较好的的价值。

由于血清中miR-21的含量远低于组织，需要寻找一种非常敏感且特异的检测方法。尽管目前有不少miRNA检测方法，如DNA/RNA杂交，芯片及测序，但实时荧光定量PCR具有快速、灵敏、特异性高、能检测出低丰度靶miRNA，国内外越来越多的公司与实验室已经和正在研发miRNA荧光定量PCR检测试剂盒。其中以ABI公司所生产的试剂盒质量较好，性能稳定，可实现高通量检测，在科研界已有应用，但因价格昂贵限制其在临床推广使用。

本发明用SYBR Green I荧光定量PCR技术建立血清miR-21检测试剂盒。在实时荧光定量PCR中，SYBR Green I染料法较ABI公司所用的Taqman探针法可使成本大大减低，但同时不可避免增加了反应的非特异性从而降低了检测的准确性。因此本实验在国内率先提出标本检测信号与背景信号两者之间信噪比的概念。同时通过系列优化与严格质量控制解决了RT-NTC(逆转录无模板对照)和PCR-NTC(PCR无模板对照)对检测准确性干扰的问题。最后建立了一种SYBR Green I实时荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒，并初步应用于乳腺癌诊断中，显示对乳腺癌辅助诊断具有较好的敏感性及特异性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测血清miR-21试剂盒及其乳腺癌辅助诊断的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于miR-21荧光定量检测的PCR引物，其包括：

miR-21逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACTCAACAT

miR-21PCR引物：

上游引物：CGCGGTAGCTTATCAGACTGATG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG。

为了避免扩增产生的误差，本发明还以miR-16基因作为内参，相关引物如下：

miR-16逆转录引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCGCCAAT

上游引物：GCGGTAGCAGCACGTAAATATTGG

下游引物：CAGTGCAGGGTCCGAGGTG

进而，本发明提供一种检测血清miR-21的实时荧光定量PCR试剂盒，其包括上述引物，并且还可进一步包括以下试剂中的一种或多种：

(1)Trizol试剂；

(2)逆转录试剂；

(3)PCR扩增试剂。

本发明所述的试剂盒中Trizol试剂，包括：重蒸苯酚200mL；8-羟基喹啉0.2g；β-巯基乙醇1.2g或二硫苏糖醇0.5g；异硫氢酸胍100g；蒸馏水118mL；0.75M柠檬酸钠7.04mL；10％十二烷基肌氨酸钠10.56mL；2M醋酸钠20mL然后混合，调节pH值至3.2-5.6，置于4℃保存，保质期约9个月。