[发明专利]一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体，其原料包括壳聚糖，其特征在于所述的原料还包括RGD，即将壳聚糖与RGD混合溶液通过高压脉冲微胶囊成型仪形成微球后，再经过冷冻干燥制孔，最终形成具有三维结构的壳聚糖/RGD三维多孔微载体。

2.如权利要求1所述的壳聚糖/RGD三维多孔微载体，其特征在于所述的壳聚糖的分子量为5.63×10⁶，脱乙酰度为91%。

3.如权利要求1或2所述的一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）、RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠溶液的制备

RGD/壳聚糖醋酸溶液的制备

将RGD与所述的壳聚糖醋酸溶液按RGD与壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖的质量比即RGD：壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖为2.0g：2.5g进行混合即得RGD/壳聚糖醋酸溶液；

其中壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖与浓度为1%（V/V）的醋酸水溶液按质量体积比计算即壳聚糖：醋酸水溶液为2.5g：100ml；

RGD/多聚磷酸钠水溶液的制备

将RGD与多聚磷酸钠水溶液按RGD与多聚磷酸钠溶液中的多聚磷酸钠的质量比即RGD：多聚磷酸钠为2.0:4.5进行混合即得RGD/多聚磷酸钠水溶液；

其中的多聚磷酸钠水溶液中，按质量体积比计算，即多聚磷酸钠:水为4.5g:100ml；

（2）、高压静电脉冲成球

将步骤(1)中的③所得的RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠水溶液在高压静电微胶囊成型仪中进行高压静电脉冲制备微球，所得的微球在RGD/多聚磷酸钠水溶液中浸泡4h后，用去离子水清洗微球直至溶液为中性，得到白色实心微球；

所述的高压静电脉冲过程控制电压为39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为7ms，频率为90Hz，液面距为20mm；

（3）、冷冻干燥制备壳聚糖/RGD三维多孔微载体

将步骤（2）所得的白色实心微球进行冷冻干燥来制孔，最终得壳聚糖/RGD三维多孔微载体。

4.如权利要求3所述的壳聚糖/RGD三维多孔微载体的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的冷冻干燥，过程控制预冻温度为-80℃，预冻时间为1h；一次干燥的温度为-30℃，时间为9-10h；二次干燥的温度为10℃，时间为1.5-2h。

5.如权利要求1或2所述的壳聚糖/RGD三维多孔微载体用于肝细胞的贴壁培养。

6.如权利要求5所述的壳聚糖/RGD三维多孔微载体在肝细胞贴壁培养方面的应用，其特征在于培养过程包括如下步骤：

（1）、壳聚糖/RGD三维多孔微载体的预处理

将壳聚糖/RGD三维多孔微载体浸入浓度为70%的乙醇水溶液中，在4℃的温度环境中保持6h，然后滤出壳聚糖微载体，并用去离子水清洗3次，之后再用配制好的pH=7的PBS缓冲液淋洗1次，再将壳聚糖微载体浸入PBS缓冲液中，4℃的温度环境中保持12h，再次滤出微载体，并用PBS缓冲液反复清洗3次；

（2）、肝细胞的接种和培养

在48孔板上按5×10⁶每孔的细胞接种密度将人肝细胞接种于步骤（1）经预处理后的壳聚糖/RGD三维多孔微载体微载体中，将48孔板轻轻摇晃10min后转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5%，湿度为100%的二氧化碳培养箱中进行黏附培养4h后，用含血清的RPMI1640培养液冲洗壳聚糖/RGD三维多孔微载体以除去未在壳聚糖/RGD三维多孔微载体上黏附紧密的肝细胞，再将黏附肝细胞的壳聚糖/RGD三维多孔微载体转移至24孔培养板，每孔加入1ml含血清的RPMI1640培养液进行培养，培养4个小时后，即得含有壳聚糖/RGD三维多孔微载体与肝细胞复合体的培养液，之后每1-2天更换含血清的RPMI1640培养液一次，培养4天后再将含有壳聚糖/RGD三维多孔微载体与肝细胞复合体的培养液进行离心分离，控制离心转速为1000r/min，时间为5min，取上层溶液，即可得到高密度、高活性的肝细胞。