[发明专利]一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于多孔材料材料制备领域，涉及一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和在肝细胞培养方面的应用。

背景技术

目前，无论是实验室还是工业生产上，所使用的细胞培养微载体主要是实心Cytodex系列的载体，且属于单层单层培养方式。而在体内，组织和细胞的生长发育过程是在三维立体的内环境条件下进行的，细胞和细胞基质以及细胞之间的相互信号传递对于调解细胞的增殖、分化有着重要影响，常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的三维环境条件，因而制备三维微载体就具有十分重要的意义。

壳聚糖是一种天然高分子惰性正电荷多糖，在生物医学方面尤其作为组织工程植入材料具有广泛的应用前景。而多聚磷酸钠/壳聚糖复合膜的拉伸强度显著高于纯壳聚糖膜。梁凯【1】等将充分溶胀的壳聚糖膜置于一定浓度的三偏磷酸钠溶液中进行交联反应制备得到三偏磷酸钠/壳聚糖复合膜，当三偏磷酸钠的浓度为0.11mol/L时，交联膜的干态抗张强度达到83.74MPa，与纯壳聚糖膜相比提高了44.81%。

目前的微载体肝细胞培养方面多用的是实心微载体，只能对细胞进行单层培养，培养的细胞量小，且有的微载体的形状不是球形，则微载体的比表面积小，相应的培养的细胞的量也会减小。

参考文献：

【1】梁凯，杜予民，李艳，张婷．三偏磷酸钠交联壳聚糖膜的制备及其性能研究【J】．分析科学学报，2008，24(2)：136-140。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体及其制备方法和其在肝细胞培养方面的应用。

本发明的技术方案

一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体，原料包括壳聚糖，其特征在于所述的原料还包括RGD，即将壳聚糖与RGD通过高压脉冲微胶囊成型仪形成微球后，再经过冷冻干燥制孔，即将微球中的水凝结成细小的冰晶，使冰晶升华形成微小的孔，最终形成具有三维结构的壳聚糖/RGD三维多孔微载体；

其中所述的壳聚糖的分子量为5.63×10⁶，脱乙酰度为91%；RGD即精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸所形成的三肽。

上述的一种壳聚糖/RGD三维多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）、RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠溶液的制备

RGD/壳聚糖醋酸溶液的制备

将RGD与所述的壳聚糖醋酸溶液按RGD与壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖的质量比即RGD：壳聚糖醋酸溶液中的壳聚糖为2.0g：2.5g进行混合即得RGD/壳聚糖醋酸溶液；

其中壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖与浓度为1%（V/V）的醋酸水溶液按质量体积比计算即壳聚糖：醋酸水溶液为2.5g：100ml；

RGD/多聚磷酸钠水溶液的制备

将RGD与多聚磷酸钠水溶液按RGD与多聚磷酸钠溶液中的多聚磷酸钠的质量比即RGD：多聚磷酸钠为2.0:4.5进行混合即得RGD/多聚磷酸钠水溶液；

其中的多聚磷酸钠水溶液中，按质量体积比计算，即多聚磷酸钠:水为4.5g:100ml；

（2）、高压静电脉冲成球

将步骤(1)中的③所得的RGD/壳聚糖醋酸溶液和RGD/多聚磷酸钠水溶液在高压静电微胶囊成型仪中进行高压静电脉冲制备微球，所得的微球在RGD/多聚磷酸钠水溶液中浸泡4h后，用去离子水清洗微球直至溶液为中性，得到白色实心微球；

高压静电脉冲过程控制电压为39-50kv，推进速度为90mm/h，脉宽为7ms，频率为90Hz，液面距为20mm；

（3）、冷冻干燥制备壳聚糖/RGD三维多孔微载体

将步骤（2）所得的白色实心微球放入冻干机中进行冷冻干燥来制孔，冷冻干燥过程控制预冻温度为-80℃，预冻时间为1h；一次干燥的温度为-30℃，时间为9-10h；二次干燥的温度为10℃，时间为1.5-2h，最终得壳聚糖/RGD三维多孔微载体。

上述所得的壳聚糖/RGD三维多孔微载体用于肝细胞贴壁培养，其培养方法包括如下步骤： 

（1）、壳聚糖/RGD三维多孔微载体的预处理

将壳聚糖/RGD三维多孔微载体浸入浓度为70%的乙醇水溶液中，在4℃的温度环境中保持6h，然后滤出壳聚糖微载体，并用去离子水清洗3次，之后再用配制好的pH=7的PBS缓冲液淋洗1次，再将壳聚糖微载体浸入PBS缓冲液中，4℃的温度环境中保持12h，再次滤出壳聚糖/RGD三维多孔微载体微载体，并用PBS缓冲液反复清洗3次；