[发明专利]猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计

权利要求书

1.猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，其特征在于，

1)Loop 2，4缺失的ΔVP2目的基因的克隆

根据GenBank中登录号为NC：001718的NADL-2基因序列为模板，用软件PrimerPremier 5.0设计引物Loop 11，Loop 22，Loop 23，Loop 14，Loop 42和Loop 43，其中Loop 11和Loop 14分别加入酶切位点，引物序列如下：

Loop 11：5-gtc-gac-atg-agt-gaa-aat-gtg-gaa-caa-c-3 sal I

Loop 22：5-tgg-att-tag-gtt-tct-gat-g-3

Loop 23：5-cat-cag-aaa-cct-aaa-tcc-aga-ctc-aat-aca-aac-agg-act-3

Loop 14：5-gcc-ctc-gag-cta-gta-taa-ttt-tct-tgg-3xhoI

Loop 42：5-ttg-ttg-ctt-tgg-agc-tct-tcc-3

Loop 43：5-gga-aga-gct-cca-aag-caa-caa-ctt-tta-cct-tca-gat-cc-3

通过SOE法基因拼接：以质粒pT VP2为模板，以引物Loop 11，Loop 22进行PCR扩增VP2片段660bp，产物在质量比1％琼脂糖凝胶上电泳后回收；以引物Loop 23，Loop 14进行PCR扩增VP2片段1047bp，产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后回收；再以上述2个回收产物为模板，引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop2缺失片段；

分别以引物Loop 11，Loop 42和引物Loop 43，Loop 14扩增VP2片段1227bp和465bp，并分别回收作模板，再以引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop 4缺失片段；将VP2 Loop 2缺失片段和VP2Loop 4缺失片段分别与pMD19-T Vector连接，转化E.coliDH₅α，碱裂解法提取质粒，分别用sal I和xho I双酶切鉴定，获得阳性质粒pTΔVP2-2和pTΔVP2-4，并测序；

2)重组质粒pShuttle-ΔVP2-2，pShuttle-ΔVP2-4的构建与鉴定

利用双酶切位点sal I和xho I分别将pTΔVP2-2和pTΔVP2-4克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、sal I和xho I双酶切及测序分析进行鉴定，分别命名为重组质粒pShuttle-ΔVP2-2，pShuttle-ΔVP2-4；

3)重组PPVΔVP2-2，PPVΔVP2-4病毒样颗粒的获得

用Pme I分别酶切重组质粒pShuttle-ΔVP2-2和pShuttle-ΔVP2-4，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasy ^TMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使pShuttle-ΔVP2-2和pShuttle-ΔVP2-4rShuttle-ΔVP2-2pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH₅α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，分别命名为pAd-ΔVP2-2和pAd-ΔVP2-4；

4)将重组质粒pAd-ΔVP2-2和pAd-ΔVP2-4转染HEK-293A细胞，获得重组病毒rAd-ΔVP2-2和rAd-ΔVP2-4；重组腺病毒表达蛋白在HEK-293A细胞中自我装配成病毒样颗粒PPV：ΔVLPs，即为获得的Loop 2，4基因缺失的重组PPVVP2病毒样颗粒。

2.权利要求1所述Loop 2，4基因缺失的重组PPV VP2病毒样颗粒在制备疫苗方面的应用。