[发明专利]猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计

说明书

一、技术领域

本发明涉及猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，属于基因工程疫苗领域。

二、背景技术

猪细小病毒(PPV)病毒粒子外观呈六角形或圆形，无囊膜，二十面体等轴立体对称，衣壳由32个壳粒组成，PPV基因组编码2条结构多肽，VPl和VP2。分子质量分别为84ku和64ku，另有一条结构多肽VP3由VP2水解而产生，分子质量60ku。其中VP2是构成病毒粒子的主要衣壳蛋白，该蛋白上包含了PPV的主要保护性抗原。VPl蛋白C端氨基酸与VP2的N端氨基酸序列相互重叠。VP2的C端暴露在该蛋白的表面，因此C段的完整性是保持该衣壳蛋白二级结构所必需的，而其N端位于二级结构的内部。

病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗递送工具，有两个突出的特色和优势：第一，以化学交联或基因工程的方法可对其表面进一步修饰改造；第二，VLPs可包裹分子量及电荷适宜的核酸或非核酸分子。这两个特点为按照不同目的灵活多样地设计、优化疫苗提供了理想的平台。概而言之，不同疫苗形式如多肽、核酸、甚至佐剂都可以单独或组合地在VLPs上挂载或负载，从而克服其各自不足。多肽-VLPs嵌合疫苗：多肽抗原易于制备，但免疫原性弱，进入机体后易于降解，这限制了多肽疫苗的实际应用。如果将多肽整合入VLPs内，则可能克服这些障碍。

VP2基因在哺乳动物细胞内或杆状病毒表达时能自主装配成病毒样颗粒并具有良好的免疫原性。Sedlik等将PPV VP2 N末端和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体PACYM，转染表达VP2-LCMV蛋白，利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的细胞毒性T细胞反应(CTL反应)，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒HBSAg决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生很强的针对插入的HBSAg决定簇的T细胞反应，并能抵抗乙肝病毒致死性攻击。现有研究表明：可以利用VP2自我包装成空壳粒子的特性，将外源基因片段插入到N末端，表达外源基因，作为一种抗原载体使用，但其携带的外源基因只能刺激T淋巴细胞诱导细胞免疫。

VLPs暴露的重复结构域能够诱导强烈的抗体应答，这使得这些结构域非常适合引入外源抗原形成VLPs，但插入位点，抗原表位大小常会干扰正确的VLPs形成。Alicia Hurtado等分别缺失犬细小病毒(CPV)VP2 loop 1，2，3，4内的相应基因，再用杆状病毒表达系统表达，结果loop 1，3，4的缺失突变株均不能表达出病毒样颗粒，而loop 2(217～234)的缺失突变株则能装配出规则的病毒样颗粒。他们进一步研究证明loop 2能容纳外源抗原决定簇。Rueda曾将脊髓灰质炎病毒C3B细胞抗原决定簇的基因分别插入CPV VP2基因的4个环内和C末端后进行融合表达，结果只有插入环2第225位氨基酸的融合蛋白能产生抗多肽反应，但不能产生抗骨髓灰质炎病毒中和反应。于是改在环2第226、227、228位氨基酸处插入，结果这些融合蛋白能产生抗骨髓灰质炎病毒中和反应。

有研究表明，PPV病毒样颗粒表面的三重轴方向有棘状突起(spike)，它是由loop形成的高级结构，位于衣壳的最表面，包含了PPV的大部分抗原表位；五重轴方向有圆柱形通道(cylindrical structure)，由5个β-ribbon形成，N末端的部分氨基酸残基在里面折叠并使中和抗原表面化；此外，五重轴周围有峡谷区(canyon)，二重轴方向有凹陷(depression)，它们可能是PPV的病毒受体。据此分析认为：VP2的N端作为插入位点虽然能够形成病毒样颗粒，但是空颗粒的N端处于五重轴的圆柱形通道内，重组体不能刺激产生B细胞抗原表位的免疫应答；构成五重轴周围的峡谷区和二重轴方向凹陷的肽段同样不适合作为插入位点。

三、发明内容

技术问题

本发明目的在于猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计及以该重组PPVΔVP2病毒样颗粒作为B细胞表位载体进行多价重组疫苗的研制。

技术方案

猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，其特征在于，

1)ΔVP2(Loop 2，4缺失)目的基因的克隆