[发明专利]检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对SalK-F和SalK-R、及探针SalK-probe组成的SalK引物探针序列集；其中，引物SalK-F的序列如SEQ ID No.1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No.2所示，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No.3所示；所述探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。

2.根据权利要求1所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，还包括由引物对virB4-89K-F和virB4-89K-R、及探针virB4-89K-probe组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由引物对cps2J-F和cps2J-R、及探针cps2J-probe组成的cps2J引物探针序列集；其中，引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No.4所示，引物virB4-89K-R的序列如SEQ ID No.5所示，探针virB4-89K-probe的序列如SEQ ID No.6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No.7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No.8所示，探针cps2J-probe的序列如SEQ ID No.9所示；所述探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团。

3.一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)选择引物探针序列集：选择由SEQ ID No.1-3组成的SalK引物探针序列集；其中，探针SalK-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、ROX、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一；

(2)实时荧光定量PCR反应：以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT；

其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因SalK的阳性判断标准是：当CT≤35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。

4.根据权利要求3所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，所述步骤(1)中还选择由SEQ ID No.4-6组成的virB4-89K引物探针序列集，和/或由SEQ ID No.7-9组成的cps2J引物探针序列集；其中探针virB4-89K-probe、探针cps2J-probe的5′端标记有报告荧光基团、3′端标记有淬灭荧光基团；

其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因virB4-89K、所述2型猪链球菌的基因cps2J的阳性判断标准均为：当CT≤35、且荧光曲线呈S形时，判断为阳性；否则，判断为阴性。

5.根据权利要求4所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：

第一阶段：初期变性，93℃-95℃30秒-120秒；

第二阶段：PCR反应，93℃-95℃变性5-15秒，60℃退火并延伸28-40秒，同时监测荧光曲线；重复30-50个循环。

6.根据权利要求5所述检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，所述实时荧光定量PCR反应的体系由以下组分构成：体系终浓度为1.25U/20μl的Premix Ex Taq聚合酶，体系终浓度为5mmol/L的镁离子，体系终浓度为0.2μmol/L的各引物，体系终浓度为0.5μmol/L的各探针，体系终浓度为0.2μmol/L的ROX Reference Dye II，待测样品基因组DNA溶液4μl，双蒸水适量；整个体系的总体积为20μl。