[发明专利]产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法

权利要求书

1.产黄青霉A096(Penicillium chrysogenum A096)，所述产黄青霉A096(Penicillium chrysogenum A096)已于2010年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010270，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

2.产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin，其特征在于所述产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的3个肽段氨基酸序列均在假定蛋白Pc21g12970序列中，具体如下序列中划线标记序列所示：

MKVTALLFTLMAATAVSASVLDTRDTCGGGYGVDQRRTNSPCQASNGDR

HFCGCDRTGIVECKGGKWTEIQDCGGASCRGVSQGGARC。

3.如权利要求2所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基，摇瓶培养，所得菌体培养液取上清；

2)在步骤1)所得的上清中加入饱和硫酸铵，得混合溶液；

3)将混合溶液离心，获得的沉淀物重溶于水中，得粗蛋白溶液；

4)将步骤3)获得的粗蛋白溶液透析，离心，以除去不溶性杂质，分装保存；

5)将步骤4)所得的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)阴离子交换色谱柱上分离纯化，按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩后，利用对该粗蛋白溶液敏感的受试真菌为指示菌跟踪活性组分，抗真菌活性检测方法为纸片法；

6)将步骤5)浓缩后具有活性的非吸附组分继续在羧甲基(CM)阳离子交换色谱柱上分离纯化，同样按紫外吸收峰出现的先后顺序依次收集各洗脱组分，各组分利用超滤浓缩管离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，采用纸片法予追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分根据SDS-PAGE电泳图判断获得蛋白的纯度；

7)割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，并经灭菌去离子水洗涤后，进行MALDI-TOF-TOF鉴定。

4.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述SGY液体培养基的组成成分及按质量百分比含量为：每100mL液体培养基中含1％葡萄糖，1％黄豆粉，0.5％酵母提取物及0.25％NaCl，其余为去离子水。

5.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇瓶培养的条件为28℃，180rpm条件下摇瓶培养5d；所述上清是将所得菌体培养液通过抽滤的方法获得。

6.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所得混合溶液于4℃条件下静置过夜。

7.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述离心，是将混合溶液于4℃，14000g下离心30min。

8.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述透析是在4℃条件下透析；所述离心，是于4℃，8000g条件下离心20min。

9.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述离心，是于4℃，5000g条件下离心；所述受试真菌选自宛氏拟青霉；所述抗真菌活性检测方法的具体步骤如下：在距受试真菌菌丝边缘约0.8cm处放置直径为0.65cm无菌纸片，并在各纸片上分别加上40μL的以上各浓缩组分和空白对照，将受试菌平板置于28℃培养箱中培养至观察到对菌丝明显抑制作用的现象为止。

10.如权利要求3所述的产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述离心，是于4℃，5000g条件下离心。