[发明专利]一种抗森林脑炎病毒马血清的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，应用于森林脑炎病毒抗血清的生产。

背景技术

森林脑炎又称蜱传脑炎(tick-borne encephalitis，TBE)是由森林脑炎病毒(tick-borneencephalitis virus，TBEV)引起的一种流行于北温带的、以侵袭中枢神经系统为主的急性病毒性传染病。世界范围内受森林脑炎病毒侵袭的国家除我国外，主要还包括：德国、奥地利、匈牙利、俄罗斯及日本等近30个国家。在我国，森林脑炎主要存在三大疫区、六个自然疫源地，主要分布于我国的大、小兴安岭地区和长白山地区，在同纬度的新疆部分地区亦有分布。根据系统进化及分布地域的不同，森林脑炎病毒可以被分为三个亚型：欧洲亚型(European subtype)、远东亚型(Far Eastern subtype)及西伯利亚亚型(Siberiasubtype)。森林脑炎病毒的三个亚型在传播媒介、致病性强弱、致死率高低以及预后等方面表现不尽相同。其中，欧洲亚型致病性相对较低，致死率约0～3.9％，预后良好，几乎无严重的后遗症发生。远东亚型及西伯利亚亚型致病性相对较强，致死率也较高，约为20～30％，且预后不好，在未死亡病例中约有25～37％的患者会留下麻痹型后遗症，从而丧失劳动能力，给社会及家庭造成严重的负担。我国流行株为远东亚型。

森林脑炎病毒在感染后采用血清疗法可以防止发病或减轻症状。血清疗法即发病3天内患者可用恢复期患者或林区居住多年者的血清20～40ml肌注，或椎管内注射5～10ml。由于现在没有已经上市的抗森林脑炎血清和免疫球蛋白，血清疗法使用的是人血清，这存在感染HIV、HCV、HBV等血源性病毒的巨大风险，而且来源非常有限，不能大范围使用。森林脑炎目前尚无有效的治疗手段，抗森林脑炎马血清可作为暴露后预防和发病早期治疗的特效药。目前无上市的抗森林脑炎病毒马血清。

马血清蛋白对人体来说属异源蛋白，对人体有很强的致敏性。马血清制品，常引起下列两类过敏反应：(1)过敏性休克，在注射过程或注射后数分钟到1h内患者突感胸闷、气急、脉搏加速、血压下降，发冷直到昏迷，重者抢救不及时，可迅速死亡。此系I型过敏反应，即人体曾注射或接触过马血清，致敏而产生IgE细胞抗体，固定在嗜碱粒细胞和肥大细胞表面，再注射马血清制品时，抗原抗体相互作用，致上述细胞破裂释放大量生物活性物质如白三烯、组织胺等，作用于机体引起过敏。(2)血清病(serum sickness)，即注射马血清制品后1～2周出现荨麻疹、发热、淋巴结肿大、脸部红肿、偶有蛋白尿、呕吐及关节疼痛等，此系III型过敏反应，即一次性接受较大剂量马血清制品注射，机体产生的相应IgG与体内残留的过敏原马血清结合，形成可溶性循环免疫复合物。沉积于毛细血管内壁，激活机体，引起局部炎症所致。

正常未经免疫的马匹体内由于自身免疫作用会有针对不同病毒的中和抗体IgG，但含量均很低，经森林脑炎病毒抗原免疫的马匹，在马匹的血清内会产生大量能够中和抗森林脑炎病毒的中和抗体IgG，IgG由F(ab)₂段和Fc段组成，其中起到中和病毒作用的成份为F(ab)₂段，而Fc段会引起过敏反应，而如何在制备抗森林脑炎马血清的过程中、获得高纯度的针对森林脑炎病毒的特异性F(ab)₂段又是十分困难的。

发明内容

本发明提供一种抗森林脑炎病毒马血清的生产方法，以解决马血清制品常引起过敏反应的问题。

本发明应用生物反应器技术培养森林脑炎病毒远东亚型“森张株”，能够获得高滴度的病毒收获液，经灭活纯化，添加适合的佐剂制备免疫抗原；选择最佳的免疫程序和采血程序，获得高特异性、高效价的免疫血清；应用以柱层析技术为核心的抗血清纯化工艺，提高抗血清纯度，增加F(ab′)₂含量。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：

(1)、森林脑炎毒株采用森林脑炎病毒远东亚型“森张株”；

(2)、采用生物反应器培养Vero细胞，感染病毒，上罐细胞密度为1×10⁶/ml，加入病毒量为1∶100～200，制备病毒原液，采用β-丙内酯灭活病毒，制备抗原，另外加入弗氏不完全佐剂；

(3)、马匹免疫程序及采血程序：一个免疫采血周期为两个月，免疫程序为0天、3天、10天、17天、35天，每次免疫为颈部皮下2.0ml/匹；采血从第15天开始静脉采血，每隔7天采一次，每次3000ml；

(4)、血浆制备；

(5)、消化、灭活；