[发明专利]灵芝属间不同品种通过原生质体融合筛选富硒高产菌株的方法

权利要求书

1.一种灵芝属间不同灵芝品种通过原生质体融合筛选富硒高产菌株的方法，其特征在于步骤如下：

（1）、筛选以原生质体融合的灵芝出发菌株：选择不同的灵芝生产菌种，进行灵芝栽培，挑选灵芝子实体产量高、产品农艺性状好的灵芝菌株作为高产的融合出发菌株；以及通过耐硒实验筛选富硒能力强的灵芝菌株，作为富硒的融合出发菌株；

（2）、筛选出的出发菌株通过以下几个方面确定其中一株为灭活菌株：

① 观察出发菌株菌丝的生长速度和外观形态及菌丝色素分泌情况；

② 原生质体的再生情况；

③ 原生质体灭活实验后的再生情况；

确定一株灵芝为灭活菌株；

（3）、原生质体融合：一株灵芝原生质体与另一株灵芝经灭活原生质体，经化学方法PEG 6000进行原生质体的融合；过程为：

PDA液体培养基：马铃薯200g煮后取汁，葡萄糖20g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，琼脂1.5g，水1000mL，pH自然；

RM₄再生培养基：麦芽糖5g，葡萄糖10g，酵母粉4g，甘露醇0.6mol／L，琼脂5.5g，pH自然，蒸馏水定容至总体积为1000mL；

渗透压稳定剂：蔗糖0.6mol／L；

酶液配制：以0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解配制的质量浓度2％溶壁酶溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后使用；

融合剂为：50mmolCaCl₂溶液配制成的30% PEG 6000；

融合步骤：

（A）菌丝体培养

菌丝体培养：取PDA斜面生长旺盛的菌丝，接种于100mLPDA液体培养基中，在三角瓶的底部放一层玻璃珠，26～28℃避光，静置培养2～4天，每日摇动三角瓶2次，用玻璃珠打散菌丝；

（B）原生质体制备

①、取一个灭菌后的空试管，称重W1；

②、用灭菌后的孔径100目铜筛网过滤培养液，收集灵芝菌丝体；

③、用无菌水和渗透压稳定剂洗涤离心菌丝体3次；

④、把离心后的菌丝体转入准备好的空试管中，称重W2，计算湿菌丝重量W2－W1；

⑤、按100mg湿菌丝加入1mL酶液的比例添加酶液；

⑥、在30℃、pH为6.0的条件下酶解2.5小时，吸取一些酶解液，显微镜下观察，用血球计数板计算原生质体数；

（C）原生质体精制

用8层擦镜纸过滤酶解液，用渗透压稳定剂共8mL分次洗涤过滤，取过滤液；4000r/min离心10分钟，去上清液，用渗透压稳定剂8mL离心洗涤，得纯化的原生质体；将原生质体用渗透压稳定剂10mL稀释，制成原生质体悬液，用血球计数板计数；

（D）原生质体灭活

取上述方法精制得到的灵芝原生质体悬液1mL进行50℃、55℃、60℃不同温度和1h、1.5h、2h不同时间的灭活处理；处理后，涂布于RM₄再生培养基上，以不灭活原生质体的作对照；

（E）原生质体再生

将精制原生质体悬液稀释至10⁵个mL^-1，吸取原生质体悬液0.2mL涂布在RM₄再生培养基固体平皿中，26-28℃培养8-10d；

再生率的计算：再生率=[再生菌落数／原生质体总数]×100％；

（F）原生质体融合

取精制得到的灵芝原生质体悬液1mL，与已经灭活的灵芝原生质体以1:1混合，4000rpm离心10min去上清液，逐滴加入1mL用50mmolCaCl₂配制成的30% PEG 6000，30℃处理30分钟，4000rpm离心10min去上清液，用灭过菌的0.6M蔗糖溶液洗涤并离心两次后把原生质体悬液涂布于RM₄再生培养基上，26-28℃恒温培养8-10d；

（4）、融合液全部再生培养，挑选有拮抗反应的菌落：

将化学融合后的灵芝原生质体悬液稀释至10^-2容度，取0.1mL涂布在RM₄再生培养基固体平皿中，26-28℃培养8-10d，利用不同菌株间的拮抗作用，挑选出有拮抗反应的菌株；

（5）、将亲本菌株和挑选出的菌株接种在PDA液体培养基中培养，挑选出与亲本菌株拮抗反应的菌株；

（6）、筛选出的菌株，挑取菌丝转至PDA斜面上培养，然后进行液体发酵试验，同时与原菌株进行酯酶同工酶电泳试验，选择液体发酵菌丝体生物量较大并且与原菌株不同的融合菌株作为初筛菌株，然后进行灵芝栽培试验验证灵芝子实体产量及硒含量；

（7）、遗传性状稳定性验证：将上述筛选后的菌株连续传代20代，然后进行栽培试验，产量稳定、性状无变化的最终确定为用于生产上的融合灵芝菌株。