[发明专利]灵芝属间不同品种通过原生质体融合筛选富硒高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种不同灵芝品种间通过原生质体融合筛选富硒高产菌株的方法，属于生物农业技术领域。

背景技术

灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，其中目前开发应用最广的是赤芝，其子实体则是进行深加工的主要原料之一。现在众多研究已经证实灵芝具有调节免疫、抗氧化、抗缺氧、抗放射、抗化疗、抗心肌缺血作用和抗衰老作用以及镇静作用、强心、调节血脂作用、降血糖、平喘、保肝等作用，广泛应用于临床对各种疾病的治疗之中。而产量高、生物性状优异的灵芝菌种是保障灵芝生产和促进灵芝产业发展的先决条件，从野外分离的灵芝菌种大多产量不高，需要经过人工驯化和不断的选育，以提高灵芝的产量和生产性状，因此，菌种的选育方面的研究就显得尤为重要了。自然选育的效率较低，而采取人工选育的方法效果较好，经过多年的研究实践，以子实体产量和农艺性状为主要目标的菌种选育已从最初的选择育种、杂交育种发展到人工诱变育种、原生质体融合育种、以及运用分子生物学技术进行育种等，在食用菌育种方法上推陈出新、不断改进，育种效率不断提高。目前灵芝方面的菌种选育研究开展的不多，主要以紫外诱变选育灵芝的报道，但是其诱变选育效率不高，新菌种产量提升不明显，效果不显著，本发明通过菌丝的生长速度、形态、色素的分泌、原生质体的再生率、原生质体的灭活时间等作为确定其中一株亲本为灭活菌株，经化学方法（PEG6000）进行原生质体的融合，然后通过菌丝形态、拮抗作用进行融合子的筛选，具有操作的简便性、实用性，提高了灵芝等食用菌菌种选育的效率。

食用菌常规的菌株选育可分为自然选育和人工选育，人工选育又分为诱变育种、杂交育种和原生质体融合育种。自然育种是利用自然变异，选取所需的有益变异。诱变育种是运用物理或化学诱变剂作用菌株的DNA，使其发生遗传变异而获得优良性状菌株。杂交育种是通过两个亲本适当的亲本染色体片段的交换和重组而获得新性状从而所育出具有双亲优良性状的育种方法。自然选育只是积累并利用自然条件下发生的有益变异，既费时又费力。诱变育种尽管具有速度快、收效大、方法比较简便等优点，但其遗传突变较大，难免存在着盲目性。杂交育种虽然具有一定的定向性，但由于食用菌是有极性的真菌，因不亲和及细胞壁的存在使得杂交育种受到一定的限制，进程缓慢。

原生质体融合是新发展起来的一种细胞工程技术，是细胞融合的一个组成部分。它是利用酶法剥除细胞壁后，在一定物理或化学条件下使不同遗传性状菌株的原生质体产生融合，使两者基因部分或全部重组，从而获得融合子。原生质体融合子的筛选鉴定是原生质体融合过程中最关键的一步，也是整个融合过程成功与否的判断。通常食用菌原生质体的鉴定，可选用营养缺陷、抗药性突变、抗代谢突变以及荧光标记作为检出标记。但工作过程比较复杂，工作量比较大。这些方法一般是在不同属间如平菇与香菇间等的融合，并且已有报道。而在灵芝同属间找出这些特征更加困难，本方法通过菌丝的生长速度、形态、色素的分泌、原生质体的再生率、原生质体的灭活时间等，作为确定其中一株亲本为灭活菌株。然后通过菌丝形态、拮抗作用进行融合子的筛选，具有操作的简便性、实用性。

目前尚未见到有关灵芝属间不同灵芝品种通过原生质体融合筛选富硒高产新菌株的任何报道。

发明内容

本发明的目的通过灵芝属间不同灵芝品种经原生质体融合筛选富硒高产新菌株。

本发明的技术方案：一种灵芝属间不同灵芝品种通过原生质体融合筛选富硒高产菌株的方法，其具体步骤如下：

1、筛选以原生质体融合的灵芝出发菌株：选择20种不同的灵芝生产菌种，进行灵芝栽培，挑选灵芝子实体产量最高、产品农艺性状好的灵芝菌株作为高产的融合出发菌株；以及通过耐硒实验筛选富硒能力强的灵芝菌株，作为富硒的融合出发菌株；20种不同的灵芝菌种分别为美国大灵芝、泰山灵芝、韩国灵芝、信州灵芝、惠州灵芝、日本红芝、日本平芝、京大灵芝、甜芝、G-F1、G-F2、G-902、韩国红芝、G1、G2、G3、G6、G8、G9、G11；

确定以美国大灵芝作为高产的融合出发菌株，惠州灵芝作为富硒的融合出发菌株。

2、筛选出的出发菌株通过以下几个方面确定其中一株为灭活菌株：

① 观察出发菌株菌丝的生长速度和外观形态及菌丝色素分泌情况；

② 原生质体的再生情况；

③ 原生质体灭活实验后的再生情况。

确定惠州灵芝为灭活菌株。

3、原生质体融合：一株灵芝原生质体与另一株灵芝经灭活原生质体，经化学方法（PEG6000）进行原生质体的融合。过程为：