[发明专利]基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法

权利要求书

1.一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15～45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；

（2）测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）的多少判断该靶基因多态性的类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中进行单碱基延伸反应的单碱基延伸反应液终浓度组成为：

单碱基延伸反应缓冲液  终浓度1～10×；ddNTP或dNTP      0.01～1.5mM；单碱基延伸反应的DNA聚合酶      0.01～1.0U/μL；特异性引物序列 终浓度为0.01～2μM；MgCl₂   终浓度为0.5～5mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量的方法选自高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（CE）或微流控芯片电泳（MCE）方法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中在步骤（1）进行单碱基延伸反应前进行PCR扩增待测基因样本，进行单碱基延伸反应使用的所测样本采用PCR扩增后的待测基因样本。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）选自ddATP/ddGTP 、ddATP/ddCTP、ddATP/ddTTP、ddGTP/ddTTP、ddGTP/ddCTP、ddCTP/ ddTTP；所述三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）选自dATP/dGTP 、dATP/dCTP、dATP/dTTP、dGTP/dTTP、dGTP/dCTP、dCTP/ dTTP。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法应用在CYP2D6基因的基因多态性检测时，所述特异性引物为具有SEQ No：1～4的序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中单碱基延伸反应在PCR仪器上进行，其条件为：92～97℃预变性1～4min；92～97℃变性5～15s，50～60℃退火10～15 s，70～75℃延伸10～15s，循环35～45次；然后降温到15～20℃保存。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量采用高效液相色谱法进行分离检测，采用的色谱条件：C18色谱柱，流动相为0.1mmol/L，pH=3.85的KH₂PO₄缓冲液，检测波长260nm，柱温30℃，流速控制在1.0 ml/min。