[发明专利]一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法

权利要求书

1.一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

2.根据权利要求1所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)酶液的制备：将15-25mM pH为5.7的MES、0.4-0.8M甘露醇、18-22mM KCl和水混合，70℃水浴3-5min；再加入8-240U/ml纤维素酶和5-20U/ml果胶酶，55℃水浴5-15min；用冰降至室温，然后加入8-12mM CaCl₂和0.05g/100ml-0.1g/100ml BSA，混匀，过滤灭菌，备用；

(2)杨树原生质体的制备：采用继代后的杨树组培苗，选取上部完全展叶的2-3片较嫩的叶片，用锋利的刀片切成叶条，并去除中脉，放入步骤(1)制得的酶液中浸透两面，28℃黑暗中静置酶解2-6h；

(3)原生质体收集和纯化：将步骤(2)酶解后的物料加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；700-1200rpm 4℃低温离心3-9min；吸除上清，沉淀加入1-2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成4-10*10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5-1.5h，使原生质体基本静置于管底，吸除上清；加入X体积的MMG溶液，重悬，若立即使用则置于室温，若保存则置于3-6℃；

(4)原生质体转化：在EP管中加入10-20μg含有外源基因的质粒，质粒体积为A；再加入步骤(3)得到的约4-10*10⁴个原生质体，体积为B；最后加入体积为A+B的PEG-Ca²⁺溶液，轻轻混匀，室温孵育12-18min，孵育结束后加入4倍体积以上的W5溶液，混匀；800-1500rpm水平离心2-10min，吸除上清；在圆底管中加入200ul-1ml WI溶液，25-28℃弱光培养15-48h。

3.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置酶解前，酶液浸透后，置于黑暗中抽真空半小时。

4.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)或(4)中，所述的W5溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，溶剂为水，22-28℃保存。

5.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的MMG溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.3-0.5M甘露醇，15mM MgCl₂，溶剂为水，22-28℃保存。

6.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的PEG-Ca²⁺溶液配方为：20-40g/100ml PEG4000，0.2-0.4M甘露醇、100mM CaCl₂，溶剂为水。

7.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的WI溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.4M-0.8M甘露醇、20mM KCl，溶剂为水，室温保存。

8.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的含有外源基因的质粒为含有外源目的基因，小于10kbp的过量表达载体质粒，该质粒携带植物35s启动子和终止子，以便于植物中表达。

9.根据权利要求2所述的将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，其特征在于，所述的杨树原生质体为杨树组培苗的原生质体。