[发明专利]一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过化学诱导将外源基因转入杨树原生质体并进行瞬时表达的方法。

背景技术

杨树以其物种丰富、分布广、适应性强、生长迅速、基因组较小、遗传转化较易等特点，已作为林木中的模式物种(Bradshaw et al.，2000；Brunner et al.，2004)，在生理生化、遗传学、分子生物学和细胞生物学等领域开展广泛研究。2006年美国能源部完成杨树全基因组测序计划(Tuskan et al.)，为杨树甚至林木功能基因组研究奠定了坚实的基础，是林木基础性研究的一大突破，并且对林木育种和改良产生深远的影响。

目前为止，已有多种基于分子和基因组水平的研究技术成功运用于杨树，如基因组测序、EST库的收集、芯片技术、转基因技术等(Jansson and Douglas 2007)。其中，以农杆菌介导的转基因方法已成为研究杨树基因功能的最普遍且行之有效的技术。但是由于转化效率较低、获得转基因植株周期长等因素，限制该技术对杨树基因功能进行大规模地筛选和分析。因此，我们需要寻找一种简便、快捷的方法来更高效地研究基因功能。

在植物中，原生质体瞬时表达分析系统可简便、高效地分析植物基因的功能(Sheen2001)。植物原生质体已去除细胞壁，是一个以细胞为基础的，可供广泛研究的实验平台。另外，通过多种手段可将像DNA、RNA和蛋白质等大分子转入原生质体中，这些手段包括：PEG融合、电穿孔和显微注射等。这样，植物中的信号传导、代谢途径和转录翻译机制可被瞬时操控，以此来研究植物的自主调节和响应(Yoo et al.2007)。这一系统已在拟南芥、玉米(Sheen 2001)、烟草(Locatelli et al.2003)、藜科植物(Lung et al.2010)、胡椒(Jeon et al.2007)等植物中应用，但是在杨树中该平台还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用PEG-Ca²⁺将外源基因高效转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，以便于更有效地筛选和分析杨树基因的功能。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法，使用纤维素酶和果胶酶将杨树叶肉酶解成原生质体，所得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

本发明中所述的瞬时表达载体通常为含有外源目的基因、小于10kbp的过量表达载体质粒，该质粒通常携带植物35s启动子和终止子，以便于植物中表达。

利用PEG-Ca²⁺将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达。

上述方法具体包括如下步骤：

(1)酶液的制备：将15-25mM pH为5.7的MES、0.4-0.8M甘露醇、18-22mM KCl和水混合，70℃水浴3-5min；再加入8-240U/ml纤维素酶(即每1mL反应液中加入10-240U纤维素酶)和5-20U/ml果胶酶(即每1mL反应液中加入5-20U果胶酶)，55℃水浴5-15min；用冰降至室温，然后加入8-12mM CaCl₂和0.05g/100ml-0.1g/100ml BSA，混匀，过滤灭菌，备用；

(2)杨树原生质体的制备：采用继代后生长较好的杨树组培苗，选取上部完全展叶的2-3片较嫩的叶片，切得尽量的细，用锋利的刀片切成叶条，并去除中脉，放入步骤(1)制得的酶液中浸透两面，28℃黑暗中静置酶解2-6h，静置前可于黑暗中抽真空半小时；

(3)原生质体收集和纯化：将步骤(2)酶解后的物料加入预冷的等体积的W5溶液，用200目细胞筛或75μm的滤膜过滤到圆底管中，圆底管放入冰中，使其保持低温状态；700-1200rpm 4℃低温离心3-9min；吸除上清，沉淀加入1-2ml的W5溶液，轻轻混匀，用血球计数板计数，计算稀释成4-10*10⁵/ml时所需溶液的体积X；在黑暗条件下冰上放置0.5-1.5h，使原生质体基本静置于管底，吸除上清；加入X体积的MMG溶液，轻轻重悬，若立即使用则置于室温，若保存则置于3-6℃；