[发明专利]轮虫雄体整体荧光染色与精子体外观察方法

说明书

技术领域

本发明属于生殖生物学和生态学环境检（监）测领域，具体是涉及轮虫精子活体荧光染色与精子离体观察方法。

背景技术

轮虫（rotifer）是淡水生态系统主要功能群，90%以上鱼类早期开口生物饵料，也是环境污染和环境风险评价受试动物。轮虫有性生殖只在环境胁迫下出现，雄体的精子活力作为环境激素风险评价具有重要理论和实际应用价值。但是雄体大小只有30微米左右（图1），精子在离体状态下仅仅能存活30-40秒种。无法在离体状态下识别精子，为其形态研究带来困难。本发明具有所需设备简单、操作简便，易于的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种轮虫精子活体荧光染色与精子离体观察方法。所提供方法包括轮虫品系和雄体获得、特异性染色和观察操作等内容。

本发明所述轮虫雄体整体荧光染色与精子体外观察方法，包括以下步骤：

（1）雄体轮虫收集；

（2）精巢和精子活体荧光染色：SYBR14预先稀释50倍备用；取1.5mL离心管，加入1mL轮虫培养液，移入雄轮虫20个，加入SYBR14稀释液5μL染色10分钟、再加PI液5μL染色10分钟后整体观察；

（3）整体压片观察：每次用1mL微吸管，吸取1个雄体，置于载玻片上，装片、整体观察。在距离样本0.5cm处置一盖玻片作为支撑，再在样本上方盖上盖玻片；把样本置于荧光显微镜下，在盖玻片上加少许香柏油，在紫外光下精巢包被在体腔内，发射绿色荧光；抽出支撑盖玻片，轮虫精子从足末端的生殖孔释放出体外，30秒钟后停止游动，在10×40放大倍数下直接观察到精子的形态结构。

本发明方法中轮虫雄性个体通过以下方法获得：水体捞取样本，在体式显微镜下挑取携带非混交卵个体，从其孵化幼体中挑选1个，单独培养，获得纯品系；投喂饵料微藻，恒温连续关照培养、用35微米筛绢过滤获取。

本发明中使用培养基均为常用培养基，其中轮虫通用培养基为轮虫人工配置培养基，每升含有NaHCO₃ 96mg 、CaSO₄.2H₂O  60mg、MgSO₄.7H₂O 123mg、KCl 4mg。根据需要利用HCl和NaOH调节pH值7.5左右。饵料微藻采用BBM培养基，每升含有NaNO₃ 250mg,CaCl₂.2H₂O MgSO₄.7H₂O 75mg, K₂HPO₄ 75 mg, KH₂PO₄ 175mg ,NaCl 25 微量元素和维生素各2mL。

光照采用20-40W日光灯，光照时间24小时，温度控制在25-30℃，每日摇动若干次或者利用旋转培养装置转速10-15转/分钟。

本发明的原理为：精子对特异性染色的反应标记精子颜色，借助盖玻片的微小压力促使轮虫精子释放到体外，进行活体精子形态显微观察。

该方法操作简便，快速，经济，便于应用。

附图说明

图1是轮虫雄体示意图。

图2是显微镜下压片后精巢显色与体外精子释放。

图3是显微镜下压片结束体外精子形态。

1-精子，2-精巢。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所说的轮虫是从养殖水体挑选的单个体，室内“克隆”培养分离培养获得。

实施例1 ：轮虫雄体获取

（1）轮虫培养