[发明专利]强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法

权利要求书

1.一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)固体培养：

取10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；

(2)种子培养：

将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-200天；

(3)分纯：

将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；

(4)发酵：

将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁷-2×10⁹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸。

2.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，琼脂10-50g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成固体培养基。

3.根据权利要求2所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，琼脂20g，KH₂PO₄1g，MgSO₄0.2g，CaCO₃1g，加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成固体培养基。

4.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述种子培养基制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基。