[发明专利]强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。

背景技术

维生素C是机体营养、生长所必需的一种微量水溶性维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用。维生素C可以作为药品、保健品、食品添加剂及化妆品营养剂，它的应用范围在扩展，市场稳定。

目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。混合发酵所使用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵，其中，氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)为产酸菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为伴生菌，若不加入巨大芽孢杆菌而单独使用氧化葡糖杆菌时，生长极端缓慢，产酸效率低，当加入巨大芽孢杆菌，可使氧化葡糖杆菌生长速率提高，产酸量增加，但是，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵2-酮基-L-古龙酸的转化率尚有可提高的空间。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。

强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：

(1)固体培养：

取存于液氮的10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28-35℃，培养24-48小时；

(2)种子培养：

将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，24h-48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；

将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-200天；

(3)分纯：

将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35℃培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；

(4)发酵：

将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁸-2×10¹¹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×10⁷-2×10¹⁰cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×10⁷-2×10⁹cfu/ml，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养72h-96h，获得2-酮基-L-古龙酸。

固体培养基的制备为：按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-12g，琼脂10-50g，KH₂PO₄0.5-5g，MgSO₄0.1-0.7g，CaCO₃0.5-5g，加水至1L，调pH为6.5-7.0，121℃灭菌20min，制成固体培养基。