[发明专利]一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(1)具体如下：甜瓜无菌苗的生成：甜瓜种子去壳后，用70％乙醇浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养2～3天，待培根长出后于3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养5～7天，得甜瓜无菌苗。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(2)具体如下：含有目的基因农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体，备用。

4.根据权利要求3所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述附加的抗生素为：50mg/L的利福平。

5.根据权利要求3所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述菌液培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(3)具体如下：转化：待步骤(1)得到的甜瓜无菌苗的子叶将要展开时，从基部将子叶剪切掉，然后取经步骤(2)活化了的农杆菌菌液涂抹在切口处，26±1℃暗培养2～3天，再在3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养。

7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(4)具体如下：筛选：当切口处长出的不定芽长到1cm以上时，剪切，移到筛选培养基上筛选培养，得幼苗。

8.根据权利要求7所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述筛选培养基的配方为：MS+含有选择标记抗性的抗生素+羧苄青霉素300mg/L。

9.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(5)具体如下：生根及移栽：将幼苗从选择培养基上转移至含有选择压的生根培养基上进行生根培养，待长出不定根后，打开瓶口，室内炼苗3天，然后从培养基中取出，洗净培养基后在水中浸泡至长出新根，而后移栽至大田。

10.根据权利要求9所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述含有选择压的生根培养基的配方为：1/2MS+0.05mg/L 6-BA+1mg/L NAA+琼脂7g/L，PH5.8。