[发明专利]一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。

背景技术

目前甜瓜的遗传转化方法主要有农杆菌介导的组织培养法，以及不需要组织培养的基因枪法、花粉管通道法和子房注射法等，简介如下：

基因枪法：利用基因枪，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法，但是其转化效率相对较低。

花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，和基因枪法类似，其转化效率较低。

子房注射法：子房注射法是对整体植株的早期胚细胞转化DNA。直接将质粒DNA注射到植物的子房，此法更适用于子房较大的植物，如西瓜、黄瓜、西瓜等。采用这种方法，无需进行细胞或原生质体的组织培养，可以在田间或温室进行，比花粉管通道或农杆菌介导的遗传转化等方法导入外缘DNA更简单，但是假阳性率较高。

在甜瓜再生体系中，农杆菌介导的组织培养法主要是利用根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有的Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染甜瓜伤口细胞后，可将T-DNA插入到甜瓜基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物转化体系，人们将目的基因插入到改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

但是由于甜瓜的再生体系建立起来相对比较困难，特别是由于甜瓜组培苗的玻璃化现象比较严重，造成了成苗及其困难的情况，大多数情况下，难以获得真正的转基因植株。这一关键技术的限制因素在于获得转化细胞之后，难以从转化的阳性细胞获得植株。所以说，尽管该方法理论基础相对清楚，技术方法最成熟，但是相对于一些组织培养再生能力较差的植物来说，该方法的应用却存在着一定的局限性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明要解决的问题是：提供一种改良的通过农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，以获得高频率的转基因植株，进行甜瓜的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。可以在一定程度上克服基因型的限制。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对适宜大小的甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株，进行子代鉴定。

所述步骤(1)具体如下：甜瓜无菌苗的生成：甜瓜种子去壳后，用70％乙醇(体积浓度)浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养2～3天，待胚根长出后于3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养5～7天，得甜瓜无菌苗。