[发明专利]一种有效抑制小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子

权利要求书

1.一种能有效抑制小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子，其特 征在于，其基因序列是：

正义，gggcaguucacugauauuatt(5’-3’)，

反义，uaauaucagugaacugccctt(5’-3’)。

2.一种能有效抑制小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子的生物 学用途，其特征在于，该小干扰核糖核酸分子的基因序列是：

正义，gggcaguucacugauauuatt(5’-3’)，

反义，uaauaucagugaacugccctt(5’-3’)，

该小干扰核糖核酸分子能够有效抑制小鼠mCD14基因表达。

3.一种能有效抑制小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子的生物 学筛选方法，其特征在于，该筛选方法按照以下步骤实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干扰核糖 核酸分子合成的基本原则，合成多个不同的针对膜结合型白细胞分化抗原14 的小干扰核糖核酸分子，选理论值最好的四对进行实验；

步骤2、按照高效转染试剂操作说明书的方法，将四对小干扰核糖核酸 分子转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，具体步骤是：

2.1)用200微升完全培养基将5×10⁵个细胞铺于12孔板内；

2.2)分别用100微升无血清的Opti-MEM I培养基稀释2微升浓度为20 微摩尔浓度的小干扰核糖核酸分子，用100微升无血清的Opti-MEM I培养 基稀释9微升高效转染试剂转染试剂，

将两个稀释物混合，充分搅拌均匀后形成转染复合物，在室温放置5-10 分钟；

2.3)将上步得到的转染复合物滴入细胞培养孔内，与小鼠巨噬细胞 RAW264.7混合，十字形轻摇以混合均匀，放入二氧化碳培养箱培养；

2.4)在培养箱37℃培养6小时后，添加700微升杜比克改良伊格氏完 全培养基；

步骤3、实时荧光定量聚合酶链式反应，检测膜结合型白细胞分化抗原 14信使核糖核酸的表达水平，具体的步骤是：

转染48小时后，吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞层1-2次，用 0.125％的胰酶进行常规消化，收集细胞，根据核糖核酸提取试剂盒说明书分 离出高品质的总核糖核酸；并测定纯化的核糖核酸浓度，采用溴化乙锭染色 电泳鉴定其完整性；使用第一链试剂盒合成互补脱氧核糖核酸；采用 ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，利用比较CT法来测 定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平，所用引物为，

针对膜结合型白细胞分化抗原14：

上游引物为：5′-AACTCGCTCAATCTGTCTTTCAC-3′，

下游引物为：5′-GCTCATCTGGGCTAGGGTTC-3′；

针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶：

上游引物为：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，

下游引物为：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′，

按照能特异抑制小鼠膜结合型白细胞分化抗原14mRNA水平，抑制效 率为最佳的标准，筛选小干扰核糖核酸分子；

步骤4、进行蛋白质印迹检测膜结合型白细胞分化抗原14蛋白表达水平 以确定干扰效果，具体步骤是：

转染48小时后，吸出培养液，磷酸盐缓冲液洗涤细胞层1-2次，0.125％ 的胰酶常规消化，收集细胞；

根据细胞沉淀的多少，依次加入：

细胞裂解液50毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、

150纳摩尔浓度氯化钠、

1％聚乙二醇辛基苯基醚、

0.2％叠氮钠、

0.5％脱氧胆酸钠、

10微克/毫升抑肽酶aprotinin、

1微克/毫升苯甲基磺酰氟；

利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样， 在12％的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后进行蛋白质 印迹，采用的抗体是，

一抗为：兔抗膜结合型白细胞分化抗原14多克隆抗体，1∶300倍稀释， 兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单抗，1∶1000倍稀释；

二抗为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G，1∶1000倍稀释，

按照小干扰核糖核酸分子能特异抑制小鼠膜结合型白细胞分化抗原14 蛋白表达，抑制效率最佳的标准，筛选得到了下述的小干扰核糖核酸分子， 能特异且高效阻断膜结合型白细胞分化抗原14蛋白表达，该小干扰核糖核 酸分子序列信息是：

正义，gggcaguucacugauauuatt(5’-3’)，

反义，uaauaucagugaacugccctt  (5’-3’)。