[发明专利]一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器及其制备方法，尤其是基于硫堇-石墨烯研制的一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器及其制备方法。

背景技术

玉米赤霉醇属于赤霉素类生长促进剂，曾作为生长促进剂应用于反刍动物，具有促进蛋白质合成的作用。然而，玉米赤霉醇所具有的弱雌激素作用，导致其在动物体液中的残留会引起机体性机能紊乱并影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，这类物质还可能致癌。同时，该物质排除动物体外后，还可经饮用水和食物造成对人体健康造成影响，多国已禁止其用于所有动物食品，在所有食用组织不得检出。

由于玉米赤霉醇具有促进蛋白质合成，提高肌肉含量，或者调节脂肪代谢的作用，用于饲养动物可以加快动物生长速度，提高肉类产量，从而达到更好的经济效益。若食用含玉米赤霉醇的食物，人类的身体健康将受到危害。因此，检测动物源性食品中此类物质的含量尤为重要。

目前检测该类物质的方法主要有薄层色谱法、气-质联用法、高效液相色谱法、液-质联用和酶联免疫法等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。与之相比，电化学免疫传感器分析法具有灵敏度高、选择性好和结构简单等特点，因此具有极高应用价值。

自从2004年石墨烯被发明以来，由于其良好的导电性及电化学活性，已经引起了广泛关注。并且，由于其独特的纳米结构及性质，石墨烯已被广泛用于合成纳米复合材料，并且构建多种电化学设备。在进一步的研究中，石墨烯及电子媒介体之间的协同作用可被用于促进电子传递过程。硫堇是一种氧化还原染料，其两个电子和两个质子间呈现出可逆的转移过程。作为一种电子媒介体，硫堇具有良好的导电性及电化学信号。

本发明基于硫堇与石墨烯的协同作用，构建一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器。该传感器提供了一种简易、经济、灵敏且特异性强的测定动物源性食品中玉米赤霉醇的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器及其制备方法。该方法进行测定时灵敏度高，检出限低，制备简单，其具体步骤如下：

(1)首先，将氧化石墨烯放入石英管并通入氩气10～20min，然后迅速加热至1000℃，并持续1min，即值得石墨烯；

(2)利用步骤(1)合成的石墨烯配制浓度为1.0mg·mL^-1的石墨烯溶液，另外配制浓度为1.0mg·mL^-1的硫堇溶液，并将得到的石墨烯溶液和硫堇溶液按照体积比0.6～1.3∶1混合15～20h，之后超声5～30min，即制得硫堇-石墨烯混合溶液；

(3)将直径为3mm的玻碳电极依次用粒径为1.0、0.3和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，再用二次水清洗干净，吹干，最后将电极置于0.05mol·L^-1铁氰化钾溶液中，在-0.6～0.6V范围内扫描，使峰电流差达到60～90mA；

(4)将2～8μL步骤(2)配制的硫堇-石墨烯混合溶液滴涂到步骤(3)得到的玻碳电极表面，晾干；

(5)用0.1mol·L^-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗步骤(4)得到的电极表面，去除未结合颗粒，晾干；

(6)滴涂3～10μL体积分数为2.0％的戊二醛溶液至步骤(5)所得的电极表面，保持湿润放置1h，二次水清洗，晾干成膜；

(7)采用0.1mol·L^-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配制玉米赤霉醇抗体溶液，滴涂3～10μL10μg·mL^-1的玉米赤霉醇抗体溶液至步骤(6)所得的电极表面，置于4℃冰箱内保持湿润1h，之后二次水清洗，晾干；

(8)滴涂3～10μL质量分数为1.5％的牛血清白蛋白溶液至步骤(7)所得电极表面，置于4℃冰箱内1h，晾干，待用；

(9)采用0.1mol·L^-1pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配制不同浓度的玉米赤霉醇溶液，将3～10μL不同浓度的玉米赤霉醇溶液分别滴涂至步骤(8)所得的不同电极表面，反应0.5～2h，晾干后连接至电化学工作站中，分别将电极浸于pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中测定其氧化还原电流变化；

(10)根据所得步骤(9)所得电流差值与玉米赤霉醇浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

一种检测玉米赤霉醇的无标记型电化学免疫传感器及其制备方法，其体现的优势和特点是：