[发明专利]一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法以及一种将制备好的固定化微球在人工湿地中的应用。

背景技术

随着工农业的迅速发展，工业“三废”排放量的增加，生活污水、医药污水、生活垃圾以及农业大量施用化肥、农药导致水资源受到不同程度污染，其中硝酸盐污染是水资源的主要污染类型之一。近年来，人工湿地在污水治理上发挥了重大作用。基质、高等植物、微生物是人工湿地发挥净化作用的三个主要因素。许多研究表明，湿地对氮的去除的首要因素是微生物的降解，基质和湿地植物的作用相对较小。由于湿地中厌氧的条件比较缺乏，反硝化过程并不能完全进行，所以对于传统意义上的反硝化而言，氮的去除并不是很彻底。20世纪70年代，固定化微生物技术开始应用于工业废水的生物处理。与其它应用游离微生物的过程相比，固定化微生物技术可以使微生物在某一固定区域具有较高的密度，减轻或消除微生物的流失，提高反应速度，同时便于培养优势微生物种群，提高处理过程的稳定性，减少或消除副反应的发生，便于控制处理过程。目前，固定化微生物技术已成为国内外生物科学、环境科学及其相关学科的研究的重点。好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化菌。自20世纪80年代，Robertson等(Robertson et al.Archives of Microbiology，1984，139，351-354)在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌以来，人们对于好氧反硝化菌的脱氮性能已经进行了一定程度上的研究，而且在此种细菌的包埋固定处理含氮废水方面也进行了一定的研究，但是将包埋固定化后的好氧反硝化菌应用到湿地系统中还未见报道。

目前，文献中已经出现了很多关于分别利用海藻酸钠和聚乙烯醇作为固定化材料进行反硝化的研究，但是对于聚乙烯醇这种合成高分子凝胶载体，它的抗微生物分解性好，机械强度高，化学稳定性好，但传质性能较差，在包埋细胞的过程中会降低细胞的活性；而海藻酸钠这种天然高分子凝胶载体对微生物无毒性，传质性能好，但强度较低，厌氧条件下易被微生物分解，使用寿命短。所以，基于上述两种材料的优缺点，本发明将这两种包埋材料结合起来进行研究，克服其各自的缺点，将更有利于增强固定化小球的各种性能，以便于更好的进行固定化小球的脱氮研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法，即采用海藻酸钠-聚乙烯醇包埋法对好氧反硝化细菌进行固定化：具有固定化微球机械强度高，稳定性好，反硝化活性高以及使用寿命长等优点，海藻酸钠价格便宜，生物相容性好；其工艺操作简单，生产成本低，易于在工业污水处理上应用。

本发明的另一个目的在于提供了一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌在人工湿地中的应用，即将固定化小球填充到人工湿地中进行好氧反硝化脱氮：有效降低水中硝态氮的含量，并使亚硝态氮的残留量几乎为零；弥补了人工湿地中厌氧环境缺乏导致的脱氮效率低下的不足。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高人工湿地脱氮效率的固定化细菌制备方法，其步骤是：

1)从增氧型复合垂直流人工湿地中筛选出好氧反硝化菌株，在恒温28℃的培养箱中进行菌株的筛选培养；

所述培养基组成是：琼脂20g，硝酸钾1g，磷酸二氢钾1g，六水氯化亚铁0.5g，七水氯化钙0.2g，七水硫酸镁1g，琥珀酸钠8.5g，溴瑞香草酚兰试剂1mL；蒸馏水1000mL，用1mol·L^-1氢氧化钠调节pH至7.0-7.3；

2)好氧反硝化细菌的菌悬液的制备：

挑选1-2环斜面保存的好氧反硝化细菌，加入到经过高温高压：121℃，105-110kPa灭菌的富集培养基中，在30℃下曝气培养5天，得到菌液；将得到的菌液离心，弃去上清液，用0.9％w/v生理盐水离心洗涤2-3次，再用0.9％w/v生理盐水稀释到500ml左右(菌体∶生理盐水＝20∶250v/v)，混合均匀，4℃贮藏备用；

所述富集培养基组成是：双蒸水750mL，硝酸钾2g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.2g，柠檬酸钠5g，微量盐溶液2mL；

3)用海藻酸钠-聚乙烯醇包埋获得固定化好氧反硝化菌：