[发明专利]猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于它含有：

（1）、样品中RNA提取液；

（2）、RT-PCR一步法反应液，其含有终浓度各0.1-0.5μM的特异性引物：

CAP-1:  5'- cgcctcgagatgaattacattccaactcaa-3'

CAP-2:  5'- ctcctgcagccattcttctgttccttctgg-3'

  (3)、猪盖塔病病毒CAP基因的阳性质粒pTCAP；

（4）、AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶。

2.根据权利要求1所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的样品中RNA提取液是TRIZOL溶液。

3.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及其应用，其特征在于所述的RT-PCR反应液，其含有终浓度各0.2μM的特异性引物。

4.根据权利要求1所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的RT-PCR反应液还含有终浓度各0.5～5mM的dATP,dTTP,dGTP和dTCP，2.0～8.0mM的Mg²⁺。

5.根据权利要求4所述的一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于其中RT-PCR反应液中dATP,dTTP,dGTP和dTCP终浓度为1mM，引物CAP-1和CAP-2的终浓度为0.2μM，Mg²⁺终浓度为5.0mM。

6.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有氯仿、异丙醇、DEPC处理的无RNase酶双蒸水、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。

7.根据权利要求1所述一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述的AMV反转录酶为5U/μL、RNase inhibitor酶为40U/μL和Taq酶为5U/μ。

8.一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品的预处理；

（2）用权利要求1～7任一所述的试剂盒进行检测，具体操作如下：

取200μl预处理的样品，加入800μl RNA提取液TRIZOL，振荡混匀，室温放置5min， 加入200μl氯仿，剧烈振摇15s，室温放置2-3min后，12，000rpm离心15min（4℃）；吸上层水相于另一新Ep管中，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，－20℃放置15-30min后，12，000rpm离心10min（4℃）；弃去上清，加75%乙醇1ml，振摇混匀，充分洗涤沉淀，7，500rpm离心5min（4℃）；弃去上清，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μl DEPC处理水中，－70℃保存备用；

（3）RT-PCR扩增

在一PCR试剂管内加入0.5-1μL的提取的样品RNA模板、RT-PCR反应液、分别加入0.2-1μL AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶，瞬时离心混匀，置PCR仪进行扩增；50 ℃反转录30 min；94 ℃ 2 min使AMV反转录酶失活；94 ℃ 变性1 min， 54 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min，同时应设立阳性和阴性对照；

（4）RT-PCR扩增产物分析

取10-20μL扩增后的样品，采用1.2-1.5%的琼脂糖凝胶中，120-150V 下电泳30-40分钟后在0.5-1μg/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察， 阳性孔有820bpDNA条带而阴性孔无的情况下，如果样品孔有820 bpDNA条带，则样品中含有猪盖塔病病毒，反之则没有。