[发明专利]猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪盖塔病病毒诊断和检测技术领域，更具体的说，涉及一种猪盖塔病病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法。该方法灵敏、特异、快速。

背景技术

猪盖塔病是由蚊虫传播的一种虫媒传染病,主要侵害马和猪。盖塔病毒(Getah virus，GETV)最初由美国陆军医学研究部门于1955年从马来西亚的雪背库蚊(C.gelidus)中分离获得，命名为Getah virus，其原型株为MM2021。此后在日本、前苏联的东部、东南亚和澳大利亚等地，从三带吻库蚊和刺忧伊蚊及猪血液中也分离到盖塔病毒。该病毒属披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alpha virus)。对鹅的红血球有很高的凝集性，能在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖。据报道，该病毒与甲病毒属中的非洲基孔肯雅热病毒(Chikungunya virus)和澳大利亚罗斯河(Ross River)病毒存在部分交叉反应。盖塔病毒含有单股RNA基因组，完整的病毒颗粒有3种多肽，对氯仿和去氧胆酸盐敏感。易感细胞系有Vero，BHK-21，C6/36，MA-104，Hmlu，RK-13等。自发现盖塔病毒以来，人们一直关注该病毒对动物的致病性。1985年在日本首次证明盖塔病毒对猪具有致病性，认为是日本初生仔猪的死亡原因之一。实验性感染妊娠母猪证明，该病毒可垂直感染而导致死产；对怀孕8d的母鼠接种后，产仔数明显减少，怀孕12 d的母鼠接种后所产乳鼠全部死亡。目前检测猪盖塔病主要的方法有病原分离，血凝和血凝抑制方法，其他分子生物学快速检测方法未见国内外有报道。病原分离需要的时间长，而且需要在生物安全三级实验室进行，而血凝和血凝抑制的特异性和敏感性不能满足检验检疫的需要。本发明采用RT-PCR方法检测标本中的猪盖塔病病毒的核酸，灵敏度高，快速仅需几小时既可得到结果，特别适合出入境检验检疫检验工作需要。本发明就是在常规RT-PCR方法的基础上研制的能快速、高灵敏地检测猪盖塔病病毒的试剂盒及检测方法。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明的目的旨在提供一种猪盖塔病病毒的RT-PCR检测试剂盒，用于猪盖塔病病毒的检测和分子流行病学调查。

（二）技术方案

猪盖塔病病毒的CAP基因是一段保守的特异的序列，通过对GenBank发布的猪盖塔病病毒CAP基因序列的比较，自行设计了一对特异的引物，研制了RT-PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中猪盖塔病病毒的方法，以实现对猪盖塔病病毒的快速、准确地检测。

其中所述猪盖塔病病毒的RT-PCR检测试剂盒，包括：

（1）    样品RNA提取液

样品中RNA提取液是TRIZOL溶液。

（2）RT-PCR反应液

终浓度各1～10mM的4中dNTPs，终浓度为0.1-0.5μM的引物CAP-1和CAP-2，终浓度为1.5～5.0mM的Mg²⁺。

（3）阳性对照

猪盖塔病病CAP基因的阳性质粒pTCAP。

（4）AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶按每个RT-PCR反应管分别加入5U、40U、5U。

此外，本发明的试剂盒里还可以还含有氯仿、异丙醇、DEPC处理的无RNase酶双蒸水、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。

本发明试剂盒的优化反应条件的优化过程：

（1）引物浓度优化  

将引物浓度选择在0.1～0.5μM进行RT-PCR扩增试验，结果表明这几个浓度的引物都能扩增出目的条带，并且当每条引物量以20pmol/μL，即0.2μM时效果最佳。

（2）MgCL₂浓度优化 

设置Mg²⁺浓度范围为2.0～8.0mM，结果表明此浓度范围内的Mg²⁺都能扩增出目的条带，并且当Mg²⁺浓度为5.0mM时，扩增效果最好，不仅无非特异性，而且扩增条带也很明亮清晰。

（3） dNTPs浓度的优化  

以终浓度为0.5～5 mM的4种等浓度的dNTPs进行RT-PCR扩增，结果此浓度范围内的dNTPs均能扩增出目的条带，并且当总dNTPs浓度为1 mM时为最佳。

本发明的RT-PCR试剂盒检测猪盖塔病病毒的方法，步骤如下：