[发明专利]一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法。尤其涉及用修饰组蛋白基因jhdm1b和jhdm1a提高诱导生成多能性干细胞效率的方法。

背景技术

我国是世界人口大国，每年因为创伤、疾病、衰老、以及遗传所导致的器官缺损、衰竭、功能障碍也居世界之首，以药物和手术治疗为基本支柱的经典医学治疗手段已不能满足临床医学的巨大需求，所以对干细胞与再生医学的研究受到了相当多科研单位以及社会各界的普遍重视。

细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，特定类型的细胞移植可被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而，细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。

干细胞是一类具有自我复制能力的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。

为了解决细胞移植治疗面临的问题，细胞命运的转化受到越来越多科学家的重视。虽然细胞分化和命运的决定一直认为是发育过程中不可逆转而且是稳定的过程，而在体外，越来越多的证据表明，这一过程是可以被逆转的。

对于细胞命运调节的研究还只是处于实验室研究状态，离临床实验还有很长的距离。这些通过转录因子过表达获得的转化的细胞还存在很多应用上的难题，比如说，病毒插入、潜在致瘤性、获得转分化细胞的纯度、在机体内能否弥补正常细胞发挥应有的功能等等。

诱导多能性干细胞(iPS，Induced pluripotent stem cell)是一种类似于胚胎干细胞、具有发育全能性的细胞，通过导入特定的基因诱导体细胞使其获得干细胞特性。2006年日本科学家Yamanaka将24个候选基因用逆转录病毒一起导入小鼠成纤维细胞，通过G418抗性筛选FBX15阳性细胞从而分离出类似胚胎干细胞的iPS克隆，最终鉴定出Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4这4个因子足以诱导小鼠FBX15-iPS细胞产生，这些细胞具有与胚胎干细胞相似的形态、增殖能力以及形成畸胎瘤的能力，但是在基因表达以及甲基化模式方面却与胚胎干细胞不同，也不能够得到活体的嵌合体小鼠；随后，该小组和其他两个小组改变筛选方法，他们以Nanog阳性细胞作为标准，得到了在多个方面均与胚胎干细胞相似的iPS，这种细胞能够产生嵌合体后代。最近，三个研究组应用四倍体互补试验分别独立证明了小鼠的iPS细胞能够发育成一个个体，具有发育全能性。

遵循诱导小鼠iPS试验的方法，2007年Yamanaka[8]和俞君英[9]两个小组分别成功地将人的体细胞重编程为iPS细胞，前者应用逆转录病毒将Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4转导入人的表皮成纤维细胞，后者则是应用慢病毒将Oct3/4，Sox2，Nanog，Lin28导入包皮细胞。基因表达谱分析，Oct3/4，Nanog基因启动子区域甲基化分析都表明人的iPS细胞系与相应的胚胎干细胞系非常相似，将这些细胞注射到裸鼠体内，都能够发育成3个胚层组织。此外，能够成功诱导体细胞转变成iPS不仅限于小鼠和人，还有大鼠、猪和猴。

能够成功重编程的细胞不仅限于成纤维细胞，很多其他类型的成体细胞也能够被诱导成为iPS细胞，包括胰腺beta细胞、成体神经干细胞、肝细胞、胃细胞、成熟B细胞、造血细胞、脑膜细胞、脂肪干细胞、脐带血细胞、外周血CD34阳性细胞、角质细胞。处于分化不同阶段的细胞，诱导其重编程为iPS的难易程度也不同，以小鼠的造血细胞为例：造血干细胞和造血祖细胞的重编程效率可以达到28％，是末端分化T细胞、B细胞的300倍。

在诱导iPS过程中常借助于逆转录病毒、慢病毒将外源基因导入细胞，通过这种方式可以得到很高的基因转导效率，但是由于病毒序列整合到细胞的基因组中，会导致基因插入突变发生，甚至具有致癌性，所以这种具有潜在危险性的基因导入方法显然不利于iPS技术在再生医学领域的应用，因此不同的研究小组采用了非整合载体来诱导iPS并取得了成功，这些载体包括腺病毒载体、普通表达载体、转座子、附加体载体、小环DNA(minicircle DNA)载体。