[发明专利]以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，单个细胞，0.7～0.8×2～3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有多种功能，是一种可以应用于多个领域的优良菌种，例如可以作为微生物农药、微生物饲料添加剂、生物有机肥接种剂、净水剂等。它的主要功能有抑制有害细菌(大肠杆菌、沙门氏菌)生长，预防腹泻、下痢等疾病；分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，降解动植物性饲料中复杂的有机物，促进消化吸收，提高饲料利用率；安全高效，无药残，无毒副作用，促进动物生长，增强动物免疫力和抗病力；减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少有害气体排放，降低养殖场所氨气、吲哚等有害气体的浓度，改善养殖环境；分解水体中的残饵、粪便、死藻等，维护水质，减少病害，减小换水量，提高水产动物免疫力、抗病力，提高成活率。 

枯草芽孢杆菌生产主要有液体发酵和固体发酵两种，液体发酵需要全套的发酵罐装置，其优点是发酵过程易于控制，产品纯度高，缺点是发酵后需要吸附干燥，工艺程序多；固体发酵一般在发酵房中进行，其优点是发酵产量高且发酵后不需吸附，直接晾干即可使用，工艺简单，缺点是发酵过程不易控制，杂菌污染不易控制。因此，采用固体发酵生产的枯草芽孢杆菌产品不适用于微生物饲料添加剂，但可适用于微生物肥料。 

目前国内大部分生产枯草芽孢杆菌的企业是采用液体发酵，例如康地恩生物集团、山东宝来利来生物工程股份有限公司等，采用固体发酵生产枯草芽孢杆菌的企业不多且规模不大。 

枯草芽孢杆菌固体发酵的原料主要是麸皮、豆粕、稻壳、玉米粉等，其中麸皮、豆粕、玉米粉为菌体生长提供碳氮源，而稻壳主要是增加固体培养基的透气性。另外培养基中还需要添加一些无机元素供菌体生长所用。枯草芽孢杆菌固体发酵过程最重要的两个因素是培养基配方和温度。由于枯草芽孢杆菌发酵过程中产热，料温升高的很快，如果控制不好，菌体生长易于提前停止。因此，通过合理的培养基配方和温度控制，以建立模式化固体发酵法生产枯草芽孢杆菌活菌的方法具有重要意义。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌的方法。 

本发明所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，步骤是： 

(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株； 

(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养24～36小时，得一级种子液；以体积比1～3％的接种量，将一级种子液再次接种于同样配方的液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养18～36小时，得二级种子液； 

(3)固体发酵培养：以5～10％质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以4～7厘米的厚度平摊于底部带空隙的料筐中，再将料筐置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30～35℃，并时常翻料使料筐中层料温不高于47℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48～72小时，发酵结束； 

(4)发酵产物晾干：将步骤(3)发酵产物平摊于干净的水泥地面上自然风干35～45小时，其间取样镜检和测定水分，当芽孢率超过70％，含水率低于10％时，风干过程结束，收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品； 

利用系列稀释法对含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出枯草芽孢杆菌的有效活菌数。 

上述液体种子培养基配方及制备方法为：以重量份计，将玉米粉0.5-2份、豆浆1-4份、葡萄糖0.1-1份、硫酸铵0.1-1份、硫酸锰0.005-0.02份、硫酸镁0.001-0.03份、磷酸氢二钾0.001-0.03份混合，加纯净水1-91份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用；