[发明专利]具有连续片光源的SPIM显微镜

说明书

技术领域

本发明涉及包括光源和照相机的SPIM显微镜，所述光源从y方向发出照射光束到要成像的对象上，所述照相机以z方向作为第一检测方向检测从所述对象上发出的荧光和/或反射光，其中z方向基本沿与y方向垂直的方向延伸。

背景技术

特别对于生物样品的分析应是快速的且不应对其造成损伤。这对很多需要生成三维图像的应用很有用。应该避免因照射光与样品的相互作用而发生的散射伪像和吸收伪像，特别是在荧光显微镜的视场下时，其中照射光具有用于激发荧光的激发光功能。

所谓的SPIM(有选择性的平面照射显微镜)技术特别适合于以高分辨率实现快速分析显微样品，且对样品不造成损伤，其中照射光产生片光源(light sheet)，同时照相机在相对于照射方向相垂直的方向上检测由光致发光和反射产生的检测光。

片光源为具有大体矩形的截面的照射体积，其在第一截面方向上(此处为z方向)非常薄，而相对于第一截面方向，第二截面方向上(此处为x方向)明显更厚。照射方向(此处为y方向)基本垂直于第一截面方向(此处为z方向)延伸，且基本沿与第二截面方向(此处为x方向)垂直的方向延伸。片光源由圆柱状透镜聚焦且该片光源的焦距或焦长可被理解为照射方向(此处为y方向)上的特定范围，其中片光源特别薄，使得被照射体积的形状为片状，即在z方向上非常薄而在x和y方向上更厚。

根据现有SPIM技术，利用圆柱状透镜产生的片光源的缺点在于，该系统很不灵活，例如其提供的是固定焦点，因此被照射体积也是预确定的。为了实现高分辨率，非常薄且长的焦距是有益的。可以在样品的一个方向上扫描该焦距以获得三维图像。由于长度增加也使宽度增加，z方向上的分辨率就降低了。这意味照射光学元件数值孔径较低时的长焦距也会使被照射体积的厚度较大。这意味着检测方向上沿光轴的光学分辨率也同样降低。

激发光和样品间的相互作用会产生散射伪影和吸收伪影，看起来像沿着照明光轴的光条纹或阴影，因此还被称为“幕帘效应”。

一种减少幕帘效应的现有方法是SPIM技术，根据该SPIM技术，并另外通过在远心布置中的谐振镜将片光源相对于光轴倾斜，使得来自各个方向照明光束入射到样品上，从而减少散射伪影和吸收伪影。简单来说，入射方向的改变给样品内的吸收区域提供了一些背景照明，使得图像中的光条纹或阴影减少。但该技术的缺点是比较复杂，特别是在片光源需要在z方向上被扫描以生成三维图像时。此外，其并没有解决因焦距是预确定的而带来的灵活性低的问题。

发明内容

本发明的目的是首先提高被描述显微镜的灵活性，同时实现高分辨率以及检测更多的图像信息。

根据本发明，上述目的通过第一x扫描仪和照明光学元件实现，所述第一x扫描仪通过在x方向上扫描照射光束产生连续片光源，其中x方向沿与y方向和z方向基本垂直的方向延伸，且片光源在由x方向和y方向所限定的平面内连续形成；所述照明光学元件包括提供在照明光束的光束路径上的变焦光学元件，该变焦光学元件可以改变照明光束的焦距。

根据本发明的优选实施例，提供光检测器检测由物体发出的位于与y方向相反方向上的检测光，该检测光的方向为第二检测方向，检测光为荧光和/或反射光。这样可以产生第二数据流，例如用于另外共焦地产生图像。可根据需要，开启或关闭该可选的另外的图像。

当使用多光子激光器时，可以选择共焦检测和非去扫描(non-descanning)光路以通过多光子检测产生图像。非去扫描检测路径的优点是，收集效率更高，尤其是在样品较厚的情况下。术语非去扫描应被理解为在检测物镜处直接从检测光中耦合出去。

如果用SPIM检测光束路径(z方向上)来收集荧光且该光被导向至光电倍增管、APD或APD阵列，那么比通过照明光学元件实现的收集荧光的效率要高得多，这是因为照明系统所使用的数值孔径一般比SPIM布置的检测系统的数值孔径小。

根据本发明另一个优选实施例，通过应用SPIM技术在z方向上检测到2维宽视场图像的同时，还可选择通过使用多光子照明，并行生成物体的共焦一维图像，该共焦一维图像为在x方向上延伸的一行。该情况下，二维图像成像的是由以上描述的片光源所照射的并由变焦光学元件控制的那个照射层，同时并行产生称为x-t的图像，即行图像，该行图像特别提供了在生物样品内的关于物体内特定单元的移动速度信息，例如分子或其他细胞部分(细胞器)的扩散。