[发明专利]一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、对表面修饰有自组装层的QCM芯片表面进行羧基功能化；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0.5h～2h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1h～2h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为1μM～2μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应0.5h～2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；所述工作液为Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM～70mM，KCl的浓度为30mM～70mM，MgCl₂的浓度为0.5mM～1.5mM；

步骤五、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后通过六通阀向反应器中加入含待测试剂的待测液，待待测液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使待测液驻留在反应器中，反应0.5h～2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，计算ΔF′与步骤四中ΔF的比值，当ΔF′/ΔF≤50％时，判定待测试剂为端粒酶抑制剂；所述工作液为Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM～70mM，KCl的浓度为30mM～70mM，MgCl₂的浓度为0.5mM～1.5mM。

2.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤一中所述表面修饰有自组装层的QCM芯片的制备方法为：将金基底的QCM芯片浸泡到总浓度为1mM～10mM的溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代异丁基十一硫醇与三羟基乙基十一硫醇的比例为1∶10～100，室温下孵育15小时，然后将QCM芯片取出，用乙醇冲洗干净，再用氮气吹干，得到表面修饰有自组装层的QCM芯片。

3.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法为：配置去离子水与甲醇体积比为1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2，2′-联吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羟基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化铜，得到淡蓝色的溶液，对淡蓝色溶液除氧10min～30min，随后向每升除氧后的淡蓝色溶液中加入0.004mmol抗坏血酸，保持氮气氛围，得到红色溶液，将QCM芯片置于红色溶液中，并将整个反应体系移至手套箱中，室温下反应4h～16h，将QCM芯片从反应液中取出，用甲醇和去离子水交替冲洗QCM芯片，然后用氮气吹干，最后将QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反应12小时，得到表面羧基功能化的QCM芯片。

4.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤三中所述氨基功能化的端粒酶引物为5′端氨基功能化的端粒酶引物，所述端粒酶引物的序列为：5′-TTT TTT TTT TAATCC GTC GAG CAG AGT T-3′。

5.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤四中所述对照液由10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。

6.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤五中所述待测液由10μL浓度为1ng·mL^-1的待测试剂，10μL含端粒酶的HeLa细胞提取物，80μL工作液和2μL浓度为100μM的三磷酸脱氧核糖核苷混合而成。