[发明专利]一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法。

背景技术

端粒是染色体末端的DNA重复序列。上世纪九十年代，有研究者提出，人体中端粒的平均长度随年龄增大而变短，而体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。细胞培养实验中也观察到端粒的长度随分裂次数增多而缩短，而且端粒长度和细胞分化程度呈反比。每次细胞复制时都会发生端粒的缩短，都伴随着端粒的缩短。端粒缩短到一定程度时，细胞染色体的稳定性就会降低，，细胞逐渐死亡。细胞复制的次数是有限的，正常人体细胞中为一般50次左右，端粒也被称作“生命时钟”。

端粒酶是一种反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体，其中RNA是一段模板序列，指导合成端粒DNA的重复序列片段。端粒酶可以催化DNA链的端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短，使得染色体脱氧核糖核酸完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。四膜虫的端粒酶发生突变时，其端粒缩短、细胞死亡，酵母端粒酶基因突变会导致端粒变短、细胞衰老。而人体细胞中端粒酶的激活和端粒延长的过程主要是在胚系细胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就受到抑制。每次细胞复制时都会发生端粒的缩短，都伴随着端粒的缩短。据报道，90％以上的肿瘤细胞中其端粒酶活性异常，癌症细胞可以无限制的分裂下去，形成肿瘤。端粒酶成为一个癌症治疗的潜在靶点，而端粒酶抑制剂也成为一种癌症治疗的潜在药物。1994年，kim等人提出了通过TRAPassay(Telomere Repeat AmplificationProtocol)的方法检测端粒酶活性。该方法往细胞提取物加入DNA引物，通过将端粒延伸后进行PCR扩增，根据PCR产物来评估端粒酶活性，达到很高的灵敏性，可以检测出50倍体细胞稀释体系中的10个癌症细胞。1996年，德国boehrioger公司推出了TRAP-ELISA试剂盒，其原理是利用Kim法处理细胞或组织并扩增端粒酶产物，引物TS含生物素，扩增产物与包被亲和素的微孔板结合，并与地高辛标记的探针结合，用酶标仪检测抗地高辛抗体标记的酶信号。最近，Anne De Cian等人研究发现，有部分端粒酶抑制剂会对PCR的过程产生影响。端粒结构中富含G序列，容易形成G4区域，而部分酶抑制剂通过与G4区域的结合从而抑制端粒延伸过程。但是该特殊结构也会抑制传统方法的PCR过程。寻找一种新的端粒酶抑制剂检测手段，对于肿瘤治疗有着重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种无标记，实时检测的利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法。该方法避免了传统端粒酶活性检测中常用的聚合酶链式扩增反应及电泳等手段，可以降低因抑制聚合酶链式扩增反应而带来的假阳性问题，同时也能有效的节约人力，有望实现高度自动化的筛选体系。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用石英晶体微天平筛选端粒酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、对表面修饰有自组装层的QCM芯片表面进行羧基功能化；

步骤二、将碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1∶1的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶质浓度为0.1M的活化液，将步骤一中经羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0.5h～2h，然后用去离子水冲洗，再用氮气吹干；

步骤三、将步骤二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1h～2h，用去离子水冲洗后用氮气吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的浓度为1μM～2μM；

步骤四、将步骤三中固定有引物的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，采用六通阀和蠕动泵作为进样装置，向反应器中通入工作液，待基线稳定后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后通过六通阀向反应器中加入对照液，待对照液全部进入反应器中，关闭蠕动泵，使对照液驻留在反应器中，反应0.5h～2h后，打开蠕动泵，通入工作液冲洗QCM芯片，读取石英晶体微天平监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；所述工作液为Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的浓度为30mM～70mM，KCl的浓度为30mM～70mM，MgCl₂的浓度为0.5mM～1.5mM；