[发明专利]一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法。

背景技术

    大豆及其制品含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人和畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、致敏原、低聚糖、植酸、脲酶及致甲状腺肿素等抗营养因子，干扰人和动物肠道内营养物质的消化吸收，破坏正常的新陈代谢，诱发过敏反应（尤其是婴幼儿及幼龄畜禽），在很大程度上限制了其在食品和饲料行业尤其是婴幼儿食品及幼龄畜禽饲料中的应用。胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗营养因子热稳定性较差，可以通过高温处理消除。大豆中的致敏原主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三种伴大豆球蛋白（α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin），其中β-conglycinin是免疫原性最强的致敏原，其热稳定性较高，常规加工处理方法很难消除。大豆与牛奶、鸡蛋、鱼、贝类、小麦、花生、坚果被列为最易引起人类过敏的8种食物。在养猪生产中，仔猪断奶前后连续饲喂含大豆蛋白日粮，会引起过敏反应，致肠粘膜受损，肠绒毛脱落，隐窝加深，肠壁通透性增加，肥大细胞数量和组胺释放量增加，进而导致腹泻、生长受阻。人们一直在探索消减大豆蛋白制品致敏性的方法，包括挤压膨化加工、微生物发酵、酶解处理等，并取得了一些进展。高效、灵敏、快捷的致敏原检测技术，是大豆及其制品利用技术开发取得成功的重要保障。

目前，大豆蛋白致敏原检测常用方法有高效液相色谱（HPLC）、聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。HPLC具有分离效率高、分析速度快、检测限低等优点，被认为是迄今为止对复杂混合物分离效能最高的一种分离分析技术，但它并不能区分被检物的免疫活性（致敏性）。PCR被广泛用于大豆、榛子、花生等食品中微量抗原成分的检测，具有敏感性和特异性高等特点。但该技术是建立在特异DNA片段PCR扩增基础上，特异性DNA的检出，并不能直接反应出样品中含有具免疫活性的致敏原的情况，从而限制了该方法在致敏原检测中的应用。致敏原的免疫原性是发生过敏反应的前提条件。以抗原、抗体特异性反应为基础的ELISA是致敏原检测的最佳选择。ELISA能够快速、准确地对样品中致敏原进行定性定量检测，并且不需要昂贵的设备和复杂的操作步骤，被广泛应用在食品和饲料行业。ELISA的关键是合适抗体的研发。彭楠等（2007）制备了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白多克隆抗体，并在此基础上建立了间接竞争ELISA方法（彭楠, 刘建峰, 梁运祥, 葛向阳. 间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白. 华中农业大学学报，2007，26（5）: 661-664）。多克隆抗体是大豆蛋白中多个抗原表位同时刺激动物产生的针对不同抗原表位的抗体混合物，既可与大豆蛋白中无致敏性的抗原表位结合，又可能与大豆蛋白以外的其它蛋白上的抗原表位结合（即交叉反应），因此以其为基础建立的大豆蛋白致敏原检测技术其结果并不完全可靠。游金明等（2008）采用人工合成β-伴大豆球蛋白上一段表位肽作为免疫抗原，制备了单克隆抗体，在此基础上建立了ELISA检测方法（游金明, 王自蕊, 谯仕彦, 贺平丽, 李德发. 致仔猪过敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备与鉴定. 中国畜牧杂志，2008，44（17）: 46-48）。但由于该表位是选自β-伴大豆球蛋白上的任意抗原表位，依然不能解决大豆蛋白中致敏性成分的特异性检测问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对β-伴大豆球蛋白α亚基IgE过敏抗原表位的单克隆抗体制备方法。用本发明方法制备的单克隆抗体，能与β-伴大豆球蛋白各组成亚基中致敏性最强的α亚基中引起IgE过敏反应的抗原表位结合，表位明确、特异性强，明显优于现有技术制备的抗体，在大豆品种选育与改良、β-伴大豆球蛋白分离纯化与检测、β-伴大豆球蛋白致敏机理研究等领域具有广泛用途。

本发明方法包括以下步骤：

步骤(1).制备抗原：采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽，然后将此表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上，制备免疫用抗原；所述的载体蛋白或载体多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白。

所述的表位小肽中氨基酸序列如下述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7的任意1条：

①NH₂-repqqpgekeededeqprpC-CONH₂；