[发明专利]一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法

权利要求书

1.一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于以传代后的成纤维细胞作为病毒株接种细胞进行细胞毒液的制备。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)消化：对长成单层的原代鸡胚成纤维细胞进行消化处理；

(2)冻存：经步骤(1)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞移入液氮罐中保存；

(3)复苏：将步骤(2)冻存后的细胞定期复苏，检查细胞的存活率，加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用；

(4)传代：对步骤(3)得到的细胞进行传代培养；

(5)制苗用细胞毒液的制备：将病毒株接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，接毒后置36～37℃继续培养，观察细胞病变，当75％以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，放-15℃以下保存备用；

(6)制苗：将有效量的步骤(5)得到的细胞毒液加入佐剂制成所述的鸡新城疫活疫苗。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)中消化处理具体包括以下步骤：

(1)在显微镜下观察长成单层的原代鸡胚成纤维细胞，待80％铺满便可经行消化；

(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量10％的比例加入0.01mol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；

(3)向清洗过的细胞瓶中加入0.25％的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1％；加完后立即放入37℃水浴中进行消化0.5～2min；待细胞完全脱落后，立即向其加入细胞瓶容量的1％体积的胎牛血清，混匀，以中止胰酶的消化作用；

(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量10％体积的含10％胎牛血清的DMEM培养液，混匀，倒入灭菌的离心管中，2000r/min离心15min，弃上清；

(5)重复步骤(4)3次。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的冻存是指将步骤(2)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞用含10％DMSO的DMEM培养液重新悬浮，分装于冻干管中，1ml/管，细胞密度要不低于1～2×10⁶/ml，4℃放置20min，-80℃过夜后，移入液氮罐中保存。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中复苏时从液氮罐中取出原代鸡胚成纤维细胞的冻干管后迅速放入37℃水浴中融化，融化后从水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(4)中细胞的传代培养具体包括以下步骤：

(1)在显微镜下观察长成单层的鸡胚成纤维细胞，待80％铺满便可经行消化；

(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量的10％的比例加入0.01mol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；

(3)向清洗过的细胞瓶中加入0.25％的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1％；加完后立即放入37℃水浴中进行消化0.5～2min；待细胞完全脱落后，立即向其加入1％体积的胎牛血清，混匀，以中止胰酶的消化作用；

(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量30％体积的含10％胎牛血清的DMEM培养液，混匀，另取2个相同规格培养瓶，每培养瓶中加入细胞瓶容量10％体积的细胞悬液；

(5)至37℃培养48h～72h，待细胞贴壁长成单层即可使用。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(5)中将病毒株用细胞维持液做适当稀释后，按细胞液体积的0.1％～1％接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，将pH调至7.2。

8.如权利要求1、2或7所述的方法，其特征在于所述的病毒株为鸡新城疫I系弱毒株。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的病毒株为鸡新城疫病毒中等毒力株Mukteswar株。