[发明专利]一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫活疫苗的制备方法，特别涉及一种通过利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，属于疫苗制备领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，对养禽业危害极大，被国际兽医局列为A类传染病。

NDV只有1个血清型，但根据其毒力的不同，可以分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。强毒株又可称为速发型毒株，中等毒力株为中发型毒株，弱毒株为缓发型毒株。根据其对不同组织器官的侵嗜性又可将有毒力的毒株分为嗜内脏和嗜神经型毒株，前者主要引起消化道出血等损害，后者导致的疾病主要表现为神经症状和呼吸道损伤。

我国于1948年首次分离到NDV，尽管我国新城疫免疫接种已经普及多年并已基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生，严重威胁着养鸡业的健康发展。目前疫苗是控制本病发生的重要手段。

自从1940开始，就在全球范围内使用新城疫疫苗，最为成功的疫苗是由缓发型病毒株和经过精心筛选的某些中发型病毒株组成的新城疫活病毒疫苗。

灭活苗自70年代开始应用，分单纯灭活苗和油乳剂灭活苗，目前应用较多的是油乳剂灭活苗。油乳剂灭活苗可以产生坚强而持久的免疫力，不会通过疫苗的使用而扩散病原。

我国目前常用的弱毒疫苗是I系，La Sota疫苗，V4疫苗。

最近几年，随着细胞培养技术的发展，细胞苗和克隆苗相继问世。克隆苗具有抗原性纯一，免疫原性强的特点。我国从美国引进的克隆N-79株型LaSota弱毒株，从I系中挑选出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遗传性非常稳定的弱毒疫苗。

细胞苗具有成本低容易生产的特点，而传代细胞可避免鸡源性潜在疾病的感染。

成纤维细胞是结缔组织最主要的细胞成分，它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来，在分泌细胞外基质成分和构建细胞外基质中扮演着十分重要的角色，在组织创伤修复过程中也发挥着重要的作用。由于成纤维细胞相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化。正是具备以上的特点，使得成纤维细胞除了应用于细胞和分子生物学的研究，还被广泛应用于病毒学研究领域，同时也是疫苗生产的重要细胞资源。

但目前市售的I系活疫苗绝大部分来源于鸡胚组织苗，因为利用现有的原代成纤维细胞生产工艺所生产的I系病毒原液，病毒滴度不稳定，批间差异较大。故此，针对原代成纤维细胞产毒不稳定这一现状，本发明在进行了大量实验研究的基础上，得出了本发明。

发明内容

针对上述存在的问题，本实验通过采用鸡胚成纤维细胞传代技术，并应用于生产实践，将传代成纤维细胞替代原代成纤维细胞。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于以传代后的成纤维细胞作为病毒株接种细胞进行细胞毒液的制备。

本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)消化：对长成单层的原代鸡胚成纤维细胞进行消化处理；

(2)冻存：经步骤(1)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞移入液氮罐中保存；

(3)复苏：将步骤(2)冻存后的细胞定期复苏，检查细胞的存活率，加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用；

(4)传代：对步骤(3)得到的细胞进行传代培养；

(5)制苗用细胞毒液的制备：将病毒株接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，接毒后置36～37℃继续培养，观察细胞病变，当75％以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，放-15℃以下保存备用；

(6)制苗：将有效量的步骤(5)得到的细胞毒液加入佐剂制成所述的鸡新城疫活疫苗。

在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤(1)中消化处理具体包括以下步骤：

(1)在显微镜下观察长成单层的原代鸡胚成纤维细胞，待80％铺满便可经行消化；

(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量10％的比例加入0.01mol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；