[发明专利]一种重组人源胶原蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。

2.一种重组人源胶原蛋白的制备方法，其特 征在于步骤如下：

（1）表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；

（2）对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；

（3）从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。

3.    根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于所述表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建如下：

    1) 基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，其核苷酸序列如SEQ NO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；

2) 将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 5021。

4.    根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于基因工程菌的培养基为：

1) 种子培养基：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油(V/V)；

 2) 分批发酵培养基：85% H₃PO₄  26.7ml/L；CaSO₄  0.93g/L；K₂SO₄  18.2g/L；MgSO₄·7H₂O  14.9g/L；KOH  4.13g/L；甘油  40.0g/L，灭菌后再加入PTM₁微量元素；其中PTM₁微量元素：CuSO₄·5H₂O  6.0g/L；NaI  0.08g/L；MnSO₄·H₂O  3.0g/L；NaMoO₄·2H₂O  0.2g/L；H₃BO₃  0.02g/L；CoCl₂  0.5g/L；ZnCl₂  20.0g/L；FeSO₄·7H₂O  65.0g/L；生物素  0.2g/L；H₂SO₄  5.0ml/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存；

3) 补料生长培养基：50%(W/V)甘油，每升含12mL的PTM₁微量元素；

4) 发酵诱导培养基：100%甲醇，每升含12mL的PTM₁微量元素。

5.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于基因工程菌的发酵培养条件及重组人源胶原蛋白诱导表达条件为：

采用分批-补料培养方法，培养温度28℃，pH5.0，即1）将种子培养基培养的菌种按10%接种量加入含分批发酵培养基发酵罐中开始培养，调节搅拌转速为500 r/min -800 r/min 、罐压为0.2-1.0bar、空气流量为200 In/h -300 In/h，使溶氧>30%；2）当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基，流加速率为维持溶氧>20%，至菌体湿重达180~220g/L，停止补加甘油；3）甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧>20%，诱导发酵96-120h后，结束发酵，收集发酵液。

6.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于重组人源胶原蛋白的提取纯化如下：对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。