[发明专利]一种重组人源胶原蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种高亲水性重组人源胶原蛋白及其制备方法。 

背景技术

胶原蛋白(也称胶原)是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖，使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性和生物降解性能。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、保健、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛的应用。另外，胶原蛋白也  可作为食品添加剂、饲料添加剂、絮凝剂、照相乳胶材料、表面活性剂和固定化酶载体材料等应用于各个工业和实验室领域。 

    目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)，从中提取胶原蛋白。但所得到的产品成分复杂，主要应用于饲料添加及微生物发酵培养基。四川铭让生物科技有限公司采用生物酶定向剪切技术，生产的胶原蛋白组成稳定，具有生物活性。但以上这些方法得到的胶原蛋白产品都有一定的病毒隐患(如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫、禽流感等)，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。 

随着DNA重组技术迅速发展，为了能充分利用胶原蛋白的优良特性，科研工作者开始寻求动物本身以外的胶原蛋白来源。有许多学者利用基因工程技术．选用各种宿主细胞(包括：哺乳动物、昆虫、酵母、大肠杆菌、转基因烟草、转基因鼠、转基因蚕细胞等)，生产重组人胶原蛋白，产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点。但是，同样存在着许多不足和困难。例如日本广岛大学的Tomita利用转基因蚕的绢丝腺分泌生产人胶原蛋白，生产的人胶原蛋白长度仅有真正的人胶原蛋白全长的1/5，且含量只有1%左右。总体来说，表达量不高、生产周期长和培养难度大、成本高是以高等动植物细胞为宿主时普遍存在的问题，且不能满足产业化、大批量生产的要求。国内有利用大肠杆菌生产类人胶原蛋白的报道（一种类人胶原蛋白及其生产方法，发明人：范代娣，公开号：CN 1371919A，公开日：2002年10月2日，中华人民共和国国家知识产权局）。而细菌表达系统普遍存在产生致热原使表达产物难以应用于临床，蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难，及其原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等不足。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用巴氏毕赤酵母进行表达的重组人源胶原蛋白，其具有优于动物体胶原蛋白的独特的化学结构和性能，同时提供该重组人源胶原蛋白的制备方法。 

实现本发明目的的技术解决方案为：一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。 

一种重组人源胶原蛋白的制备方法，步骤如下： 

（1）表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；

（2）对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；

（3）从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)设计的人源胶原蛋白基因Ge1是全新的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；(2)该人源胶原蛋白基因Ge1同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征；(3)在人源胶原蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的酵母表达研究中实现接近较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；(4)该种不同重复数同向串联基因重组质粒的制备方法，仅仅通过简单的体外酶切连接反应和具有成熟技术的原核转化和筛选，实现了任意重复数的目的基因(重组人源胶原蛋白基因Ge1)的串联连接；(5)该法比较现有的许多应用PCR技术实现重复更具有可行性和更易获得成功．避免了达到重复串联目的基因的PCR操作中需要的高难度的引物设计和条件探索工作；(6) 可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞内和胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等。 

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。 

附图说明

图1是重组人源胶原蛋白的SDS-PAGE检测。 

图2是纯化过程中的凝胶过滤层析图谱。