[发明专利]一种用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因多态性，进而指导华法林选择用药剂量的试剂盒。

背景技术

华法林是属于香豆素类药，通过抑制维生素K依赖性凝血因子的合成，延长凝血酶原活化时间，达到抗凝的目的。它在临床上常用于治疗血栓性疾病，具有抗凝和溶栓的双重作用，是目前国际上最常用的长效抗凝剂，也是治疗和预防静脉血栓性疾病的主要药物之一。但华法林的有效血药浓度范围狭窄，剂量偏小会降低治疗血栓形成的效果，剂量偏大则会增大出血的风险，甚至引发大出血等副作用。

临床上常以凝血酶原时间(PT)及国际标准化比率(INR)作为监测指标，以达到安全有效地使用它。因此临床医生常先给予一定标准剂量，然后根据每个患者INR值的情况，增加或减少剂量直至INR达到靶标，从而确定需要的维持剂量，长时间的进行维持治疗。使用华法林的另一个特点是其稳定剂量在不同种族间及个体间存在着较大差异，不同个体间稳定剂量的差异可达20倍以上。因此，将不同患者的华法林剂量调整到既安全又有效的范围，是长期以来临床用药上一个非常棘手的问题。

造成华法林用量个体差异的原因很多，可分为非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要有年龄、身高、体重，药物的相互作用，饮食习惯，疾病状态等。然而，非遗传因素的影响程度较为有限，并非华法林用量个体差异的主要原因。近年的研究表明，遗传因素在华法林用量个体差异的表现中起到关键的作用。影响华法林用量个体差异的遗传因素是指与华法林的药动学和药效学有关的蛋白或酶的基因发生变异，影响蛋白的表达或酶的活性，从而增强或降低华法林的疗效，使不同个体间的用量产生差异。目前，已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(VKORC1)和细胞色素2C9(CYP2C9)的多态性是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。到目前为止，已发现的CYP2C9等位基因有30余种，其中以*l(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最为常见，而VKORC1主要表现为G-1639A位点多态性。目前，研究人员更倾向于将遗传因素与非遗传因素相结合，建立新的华法林稳定剂量预测算法，提高了剂量预测的效能。大多数这样的算法可解释华法林用量个体差异50%以上的原因。研究显示VKORC1和CYP2C9的多态性对华法林用量个体差异的贡献比例分别6-37%和5-22%。

因此，通过对患者的基因进行检测，来确定华法林需求的维持剂量，就可以实现个体化用药，既可避免剂量不够造成血栓，又可防止剂量过大引起出血并发症。采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性，可为临床提高华法林应用的安全性和有效性提供一种全新的快速简便的基因诊断技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异的检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，为临床个体化使用华法林剂量提供依据。

本发明的试剂盒利用基因测序技术，设计了VKORC1和CYP2C9基因PCR扩增引物，为此，本发明首先提供一种用于VKORC1和CYP2C9基因多态性检测的引物：

1）VKORC1第3外显子基因

上游引物序列为：5′- CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ′，

下游引物序列为： 5′- CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ′ ；

2）CYP2C9第3外显子基因

上游引物序列为：5′- GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3’，

下游引物序列为：5′- ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3’；

3）CYP2C9第7外显子基因

上游引物序列为：5′- GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3’，

下游引物序列为：5′- AATGTCACAGGTCACTGCATG -3’。

进一步本发明提供一种利用基因测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其包括上述VKORC1和CYP2C9基因多态性扩增引物。基于此，本发明可以采用现有常规方法提取人外周血基因组、进行PCR扩增、并测序。优选本发明试剂盒进一步包括以下试剂中的一种或多种：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和PCR测序试剂。

其中人外周血基因组提取试剂包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24：1)混合液，异丙醇和无水乙醇。