[发明专利]单链cDNA合成、微阵列用样品制备及核酸检测的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及单链cDNA的合成方法、及从由该合成方法得到的单链cDNA，制备提供给使用微阵列的核酸的检测的样品的方法。另外，本发明涉及从该样品通过微阵列检测检测对象的核酸的方法。

【背景技术】

近年，作为用于检测检测对象的核酸的工具，微阵列受到关注。微阵列也称为DNA芯片，是作为探针的核酸片段在塑料或玻璃等的基板上高密度配置的微阵列。通过使此微阵列的探针和样品中的核酸(DNA、RNA、cDNA或cRNA)杂交，可同时一并解析待测样品中含的多数的基因。

如此，微阵列在基因的表达解析、变异解析等中非常有用。将微阵列应用到临床检查的尝试也开始。

在使用微阵列的核酸的检测中，样品中的要检测的核酸是微量时，核酸的检测精度降低。因此，从升高由微阵列的核酸的检测精度的观点，已知扩增样品中的核酸，制备微阵列用样品(参照国际公开第01/038572号、美国专利公开No.2002/127592、及，特开2007-300829号公报)。

以往、由微阵列解析基因表达时，首先从活体样品提取RNA，将其作为模板合成单链cDNA。从此单链cDNA合成双链cDNA，再从此双链cDNA通过体外转录(in vitro transcription：IVT)反应扩增cRNA而得微阵列用样品。此微阵列用样品中含的cRNA，对于供给到微阵列而言浓度过高的情况多。因此，将样品供给到微阵列之前，定量cRNA而稀释成适宜的浓度。

如此，使用由以往的核酸扩增得到的样品通过微阵列检测检测对象的核酸时，有必要进行样品中含的核酸浓度的定量，和样品的稀释的烦琐的操作。

在由微阵列的核酸的检测中，一般地存在如下(1)～(4)的步骤：(1)从活体样品的核酸的提取、(2)提取的核酸的扩增、(3)核酸的扩增产物和微阵列的探针的杂交、及，(4)微阵列的测定。现在，使上述的(3)及(4)的步骤自动化的装置已有市售。但是，尚未开发出使全步骤自动化的装置。这是由于，在从(2)到(3)的步骤中，必要测定样品中的核酸的浓度，应其测定结果判断适宜地稀释，而将此浓度测定及稀释的作业自动化是困难的。

本发明以提供无需定量及稀释，在微阵列用样品的制备中使用的，合成单链cDNA的方法作为目的。本发明另外，以提供使用该单链cDNA的合成方法的微阵列用样品的制备方法、及使用微阵列的核酸的检测方法作为目的。

【发明概述】

本发明的范围仅由随附的权利要求确定，且不以任何程度受此发明概述中的说明的影响。

本发明人发现，通过在单链cDNA的合成反应中，以极其低的浓度使用引物来得到单链cDNA，从此单链cDNA合成cRNA，而无论以何量的RNA作为模板使用，均可得到大致一定量的cRNA，从而完成本发明。

即，本发明是：

(1)单链cDNA的合成方法，其包括：

以从活体样品提取的RNA作为模板，使用有寡dT及启动子序列的引物合成单链cDNA的反应；其中

在合成单链cDNA的反应中，以终浓度500pM～500nM使用上述引物。

(2)(1)所述的合成方法，其中

上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。

(3)(1)所述的合成方法，其中

在合成单链cDNA的反应中，作为反应溶液中含的模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。

(4)微阵列用样品的制备方法，其包括：

从活体样品提取RNA的步骤；

使用含提取的RNA、以及，具有寡dT及启动子序列的引物的反应溶液，合成单链cDNA的步骤；及

以合成的cDNA作为模板合成检测用核酸，制备微阵列用样品的步骤；其中

在合成单链cDNA的步骤中，上述反应溶液中的上述引物的终浓度是500pM～500nM。

(5)(4)所述的制备方法，其中

上述活体样品是血液、淋巴液、尿、组织或细胞。

(6)(4)所述的制备方法，其中

在合成单链cDNA的步骤中，作为模板使用的RNA的浓度是0.005～0.5μg/μL。

(7)(4)所述的制备方法，其中

在制备微阵列用样品的步骤中，检测用核酸是cRNA。

(8)由微阵列的核酸的检测方法，其包括：

从活体样品提取RNA的步骤；