[发明专利]微生物酶转化棘白菌素B的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，更具体地，本发明涉及通过微生物酶将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。

背景技术

上世纪70年代以来，真菌感染无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加，特别是在免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者、肿瘤患者以及那些患有其它疾病而正进行免疫治疗的患者中。直到20世纪80年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功，临床方能有效而安全地控制真菌感染。虽然这些药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物选择性差、耐药真菌的出现以及对诸如曲霉和白色念珠菌等真菌的敏感性不强等原因，深部真菌感染疾病的死亡率仍居高不下。因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。

众所周知，真菌细胞具有细胞壁而哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，真菌细胞壁是新型抗真菌药物的理想靶点。棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物，由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β-(1，3)-D-葡聚糖的合成，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。其作用机制独特，不良发应率低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白色念珠菌等感染趋势上升的真菌具有良好的杀灭作用。棘白菌素类抗生素主要有三种类型：B，C和D。其中棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)是最主要的类型。ECB，是于1974年Nyfeler R.等人发现的由曲霉菌属Aspergilus nidulans和Aspergilusrugulosus发酵产生的，但由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB为先导化合物进行结构改造，可以得到一些具有临床应用价值的化合物，如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin，MK991)、米卡芬净(Micafungin，FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin，LY303366)。西洛芬净由于毒性和剂型问题终止了研究开发，但后三者已先后在美国(2001年)、日本(2002年)、美国(2006年)首次上市。

其中阿尼芬净是由礼来公司和Vicuron Pharmaceuticals公司联合研制开发，给药途径为静脉滴注。动物实验研究表明，同卡泊芬净和米卡芬净相比，阿尼芬净对烟曲霉菌活性更强，对白色念珠菌活性相对较弱。其制备过程包括以下两步：(1)通过微生物转化——游动放线菌发酵产生的脱酰化酶对棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)进行催化，使侧链断裂，生成母核(EchinocandinB Nucleus，ECBN)和不饱和脂肪酸侧链。(2)在母核的基础上采用化学合成的方法加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。其中母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备，化学方法成本较高，微生物转化具有以下优点：反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。

美国专利US7785826B2详细介绍了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括：将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化。但此工艺转化耗时20～30h，且ECB脱酰酶仅利用一次。

因此，仍需开发微生物酶转化棘白菌素B的方法。

发明内容

鉴于现有技术的上述状况，本发明提供一种简单的将棘白菌素B(ECB)转化成棘白菌素B母核(ECBN)的方法，该方法包括以下步骤：

1)微生物发酵获得棘白菌素B脱酰酶；

2)发酵完成后，往发酵液中添加磷酸盐，进行超声，离心取上清液，即为棘白菌素B脱酰酶粗酶液；

3)纯化粗酶液，得到棘白菌素B脱酰酶酶液；

4)将棘白菌素B溶于乙醇中，与脱酰酶酶液混合并搅拌使其转化为棘白菌素B母核，转化完成后，过滤，取滤液；

5)滤液过大孔吸附树脂，棘白菌素B母核吸附于树脂上，用有机溶剂将棘白菌素B母核洗脱下来。

以下详细说明本发明方法的各步骤：

上述方法的步骤1)中，发酵所用菌株可以是天然产酶菌，例如犹他游动放线菌；也可以是基因工程菌，例如白色链霉菌基因工程菌株。可采用本领域技术人员熟知的条件进行棘白菌素B脱酰酶的发酵。