[发明专利]一种检测猪痢疾的PCR试剂盒及引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪痢疾的PCR试剂盒及引物，属于检验检疫领域。

背景技术

猪痢疾（Swine dysentery；SD）的病原体是一种革兰氏阴性的厌氧性螺旋体，先后命名为是由猪痢疾密螺旋体（Treponema hyodysenteriae;T.h）、猪痢疾蛇形螺旋体（Serpulinahyodysenteriae；S.h）。现在统一命名为猪痢疾短螺旋体（Brachyspira hyodysenteriae；B.h），目前猪痢疾密螺旋体这一名称由于历史的原因还被广泛使用。该病是猪的一种肠道传染病，以黏液性或黏液出血性腹泻为特征。在猪群中的发病率相当高，病猪生长发育受阻，耗料增加，给各地养猪业造成很大的经济损失。据统计病猪的饲料消耗率为正常猪的2倍，而增重率仅为正常猪的1/2。根据1983年Lyson的统计，为控制猪痢疾在饲料中添加的药物，每头猪花费2.5-2.8美元。根据Wood等（1988）的计算，猪痢疾猪群的饲料消耗，每头上市猪要多花12.6美元，同时每头猪还要多花费2.4美元。在美国估计每年由于猪痢疾而损失6400万美元。

该病遍布五大洲50多个国家和地区。在我国，许多省、市都有该病的存在，并且一旦传入猪群，若不采取严格的处理措施很难根除。

1978年10月，上海口岸在从美国进口的451头商品猪的检疫中确诊猪痢疾后，1979年初又在我国猪只中确诊猪痢疾，并从国内猪只分离得到猪痢疾短螺旋体纯培养，引起我国兽医界的重视，并被列入《中华人民共和国进境一、二类传染病》。

在进出口的双边协议中美国、英国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、爱尔兰、及日本等国的进口猪要求进行猪痢疾短螺旋体的检测。现有检测条件要求高（严格的厌氧培养），一般实验室很难满足检测的要求。

到目前为止，该病还没有满意的简单可行的检测方法。在入境检测中采用行业标准SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》，检验周期要两周时间，并且要求严格的厌氧培养监控，因此急需一种快速、敏感、特异性强的检测方法以替代或者补充该规程。

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR，PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

PCR技术具有以下优势：

1.特异性强 

　　PCR反应的特异性决定因素为： 

　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 

　　②碱基配对原则； 

　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 

　　④靶基因的特异性与保守性。 

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 

2.灵敏度高 

　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10^-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10^-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 

3.简便、快速 

　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 

对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。