[发明专利]一种新的shRNA表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种用于shRNA介导基因沉默的shRNA构建载体。其特征在于：

采用PIII型H1启动子并对其3’端进行了突变使其最后3-5个碱基均改变为T；

含有两个SapI(或BspMI，BbvII，BsmI)酶切位点进行shRNA构建。

2.一种shRNA的克隆方法，包括仅需合成两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，在退火后自身互补配对而形成长双链DNA片段后，插入用限制性内切酶酶切得到的线性化的载体，得到环形的DNA分子。随后将环状DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。

3.根据权利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，两条同种链在自身退火后能够形成长双链寡核苷酸片段。

4.根据权利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于，退火形成的DNA片段能够和权利要求1中的酶切后载体通过互补的粘性末端连接。

5.根据权利要求1所述的载体和权利要求2所述的方法，其构建的shRNA采用具有回文序列的环序列。

6.一种基因治疗载体，其特征在于含有权利要求1中shRNA结构相连的表达调控序列以及权利要求2中的shRNA结构。