[发明专利]一种新的shRNA表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种新的shRNA表达载体，本载体可通过双短链或者单长链退火的方法实现低成本、高效地shRNA克隆。

背景技术

功能缺失的表现型在寻找和验证基因和生物功能方面关系中起着重要作用。RNAi诱发的基因沉默现象具有高效性、高特异性等特点，已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤、基因功能组学、细胞信号转导通路等方法的研究。shRNA是一种非常有前景的RNA干扰技术。

传统的shRNA克隆方法，是合成两条序列不完全相同的寡核苷酸片段，将这两种寡核苷酸片段在退火形成双链后，插入用限制性内切酶双酶切得到的线性化载体，从而得到环形的DNA分子，随后将环状DNA分子转化大肠杆菌，通过筛选得到正确的基因克隆。上述方法一般需要每条链合成60碱基以上，两条链需合成碱基120nt以上。

本专利中我们描述一种通过双短链或者单长链构建shRNA的新方法及其载体，可快速、高效的实现shRNA的克隆表达，尤其是其具有低成本、高构建成功率、高抑制率的优势，仅需合成50多个碱基即可实现shRNA的克隆，更适用于大规模shRNA的克隆筛选。

发明内容

本发明的目的在于对传统的shRNA克隆方法进行改造，从而提供一种新型的shRNA克隆载体及其构建方法。具体说，本发明涉及通过双短链或者单长链退火构建shRNA的新载体及其新方法。

本发明的shRNA克隆方法包括制备合适的克隆载体、双短链或者单长链自身退火形成长双链DNA并与本发明的载体进行连接得到环形DNA分子，通过转化在大肠杆菌中进行复制扩增。其特征在于：

本发明的新载体采用PIII型H1启动子并对其3’端进行了突变使其最后3-5个碱基均改变为T；

构建的shRNA采用具有回文序列的环序列，因此仅需合成两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，在退火后自身互补配对而形成长双链DNA片段；

所述载体和自身退火后的DNA双链均具有碱基序列相同的粘性末端，且同为5’端或3’端的突出端。

所述载体和自身退火后的DNA双链长度的粘性末端突出段为1-5个碱基，所述碱基包括：A和T；

所述载体和自身退火后的DNA双链能够通过相同的粘性末端进行互补配对；

根据本发明，最后还包括将连接到环状DNA分子及转化到细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。

总体来说，本发明提供的载体和shRNA克隆方法，只需要合成双短链或者单长链寡核苷酸片段，自身退火后与改造后的载体通过相同的粘性末端连接，可以高效、方便、低成本地实现shRNA克隆。

本发明另一方面提供了一种基因治疗载体，所述构建物含有本发明上述shRNA结构以及与所述shRNA结构相连的表达调控序列。

本发明所述的shRNA基因治疗载体适用于人类细胞或组织、各种哺乳类动物细胞或组织以及转基因动物。

附图说明

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合图表、附图来说明本载体及本载体的构建方法及其适用性。

图1本发明载体pshOK-basic的示意图

图2基于本载体的环序列以及正义反义序列方向的优化

图3基于本载体的两种shRNA构建方法比较

图4基于本载体抗LacZ基因的shRNA对LacZ的抑制效果

图5基于本载体抗Gluc基因的shRNA对Gluc的抑制效果

具体实施方式

本发明提供了一种通过双短链或者单长链寡核苷酸构建shRNA的新方法，可以高效、方便、低成本地实现shRNA克隆，以下通过实例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一pshOK-basic克隆载体的构建