[发明专利]MLPA长探针制备方法、转基因玉米MLPA长探针及检测方法

权利要求书

1.一种MLPA长探针的制备方法，所述制备方法包括，

采用引物对以模板进行不对称PCR扩增，然后用限制性内切酶处理不对称PCR扩增产物，凝胶电泳经过酶切处理的不对称PCR扩增产物，切胶回收不对称PCR扩增产物中的单链DNA，即得到MLPA长探针；

所述模板为与检测靶标序列无关的序列，所述不对称PCR扩增产物的序列内包括有多克隆位点，所述限制性内切酶与多克隆位点对应；

所述引物对的一条引物从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段；

所述引物对的另一条引物从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述引物对中从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段的一条引物为不对称PCR中的非限定引物，另一条引物为限定引物；所述非限定引物的5’端具有磷酸化修饰。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述模板为PUC18质粒，所述限制性内切酶包括HindIII、EcoR I中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述非限定引物为不对称PCR中的上游引物，所述限定引物为下游引物；所述上游引物位于PUC18质粒多克隆位点的左侧，含有Seq ID No.2所示序列。

5.一种检测转基因玉米的MLPA长探针，其特征在于：所述长探针的5’端带有磷酸化修饰，从5’端到3’端依次包括T2、UT、P2区段，所述P2含有SeqID No.11所示序列；

所述T2含有Seq ID No.3所示序列，所述UT含有Seq ID No.12所示序列，

或者所述T2含有Seq ID No.5所示序列，所述UT含有Seq ID No.13所示序列。

6.根据权利要求5所述的MLPA长探针，其特征在于：所述MLPA长探针的制备方法包括，采用引物对以PUC18质粒为模板进行不对称PCR扩增，回收扩增产物中的单链DNA，即MLPA长探针；所述引物对由非限定引物和限定引物组成，所述非限定引物的5’端带有磷酸化修饰；

所述非限定引物含有Seq ID No.7所示序列，所述限定引物含有Seq ID No.8所示序列；

或者所述非限定引物含有Seq ID No.9所示序列，所述限定引物含有Seq IDNo.10所示序列。

7.一种检测转基因玉米的MLPA短探针，其特征在于：所述短探针从5’端到3’端依次包括P1和T1区段；所述P1含有Seq ID No.16所示序列，所述T1含有Seq ID No.17或者Seq ID No.18所示序列。

8.一种转基因玉米的MLPA检测方法，其特征在于：所述检测方法包括采用权利要求5或6的MLPA长探针与权利要求7的短探针以转基因玉米品系的DNA序列为模板进行杂交。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的长探针和短探针进行PCR扩增，所述通用引物的上游/下游引物分别含有Seq ID No.16和Seq ID No.1所示序列。

10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于：还包括采用对转基因玉米内源基因进行MLPA检测的两条探针，所述两条探针分别含有Seq IDNo.21和Seq ID No.22所示序列，Seq ID No.22所示序列探针的5’端带有磷酸化修饰。