[发明专利]MLPA长探针制备方法、转基因玉米MLPA长探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分子检测领域，特别是涉及一种用于MLPA检测技术的长探针的制备方法，由此方法制备的用于转基因玉米MLPA检测的长探针，以及转基因玉米的MLPA检测。

背景技术

目前基因检测以PCR技术为主，检测快速、灵敏度高、结果准确、可靠。然而，PCR方法单管只分析一个基因，效率低。当前要对如众多转基因品种和品系逐一筛查，工作量太大，成本高。因此，基因检测急需一种高通量检测方法。

常见的高通量基因检测技术有基因芯片、多通道毛细管电泳和DHPLC分离技术等。然而，这些方法一般只能进行“单对多”的检测(单样品对多项目)，“多对多”方式的检测(多样品对多项目)能力有限，其有限高通量的发挥还取决于上机样品所含被检目标基因数。为一次性获得多目标DNA片段，人们采用多重PCR法，但引物间相互干扰和引物多聚体使该技术检测基因数目很难超过10个。

多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex Ligation dependent Primers Amplification MLPA)由荷兰的Dr.Schouten JP于2002年报道，最初应用于医学检测目的。其原理是针对不同的感兴趣基因位点设计长度各不相同的探针对，探针对两序列的一端具基因特异性，它们与各自目标基因区域复性后仅留一缺口，于此同时所有探针对中与目的基因不杂交的一端都接有相同的碱基序列(既通用序列)用于PCR，这样当探针对与目标区复性并在连接酶的作用下相连而本身成为PCR模板DNA，并由一对公用引物扩增而以信号放大，由于针对不同的感兴趣基因位点设计的探针对长度各不相同，经分离PCR产物大小(不须测序)便可知道是否有目标基因的存在，在并能进行相对定量分析。

MLPA技术包括探针的设计、探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分离及数据收集等过程。具有经济(不需昂贵设备)、特异性高(探针复性及连接酶识别)及高通量(单管可测多达40多个基因)的特点。此外，该法检测所针对的基因目标区可短至40-50bp，特别适于DNA高度降解样品的检测。至今，MLPA技术已应用于很多领域，如单核苷酸多态性和基因突变检测、基因片段缺失和重复、染色体数目异常、基因甲基化检测及mRNA分析等等。

以上MLPA技术原理显示，多基因位点凭其最终PCR扩增片段长度的不同而相互区别。为了能清晰分辨不同基因位点PCR扩增片段DNA，特别是在采用低分辨率的琼脂糖凝胶电泳分析MLPA产物时，必须拉开各扩增片段的差距。因此，在单链探针设计和制备时必须将探针之间的大小拉开，随着被检测目的基因的增加，单链探针的长度也要增加，而单链长探针的制备则是难点。

单链探针制备最简单的方法是采用化学合成法，但是，当单链探针超过100bp时，化学合成法则不合适，因为出现合成错误的概率大大增加，合成的产量也大大降低。为克服单链探针制备的困难，发明MLPA的荷兰公司MRC-Holland开发了基于一套M13载体的单链探针制备方法，其原理就是将各M13载体的大小不同的无关序列或无关的模板(Unrelated Template，UT)引入单链探针从而获得长度不同的单链探针。该单链探针生物方法非常繁琐，不仅需要基因克隆、病毒转染、质粒提取等过程，还必须购买一套昂贵的M13载体，此外，操作M13病毒极易发生污染。为垄断MLPA应用市场，现在荷兰公司MRC-Holland不再出售M13载体，因此，单链长探针的制备急待克服。

发明内容

本发明的目的是针对上述MLPA长探针生物制备方法繁琐的问题，提供一种简单、无污染、高效的MLPA长探针制备方法。

本发明的另一目的是提供一种用于转基因玉米MLPA检测的长探针、短探针以及转基因玉米的MLPA检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公布了一种MLPA长探针的制备方法，包括采用引物对以模板进行不对称PCR扩增，然后用限制性内切酶处理不对称PCR扩增产物，凝胶电泳经过酶切处理的不对称PCR扩增产物，切胶回收不对称PCR扩增产物中的单链DNA，即得到MLPA长探针；所述模板为与检测靶标序列无关的序列，所述不对称PCR扩增产物的序列内包括有多克隆位点，所述限制性内切酶与多克隆位点对应；所述引物对的一条引物从5’端到3’端依次包括与检测靶标序列相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段；所述引物对的另一条引物从5’端到3’端依次包括与MLPA通用引物相匹配的区段和与所述模板相匹配的区段。