[发明专利]一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺

权利要求书

1.一种医用水蛭素编码基因，其特征在于，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

2.一种医用水蛭素基因编码的多肽，其特征在于，具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

3.一种包含权利要求1所述基因的重组载体，其特征在于，将权利要求1所述基因加入到pMPT121质粒中，所述重组载体为pMPTaRBHV。

4.一种包含权利要求3所述重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为汉逊酵母菌RB-11。

5.一种包含权利要求3所述重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的外源蛋白表达为[Ile¹，Thr²]-63位脱硫基水蛭素。

6.一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌，其特征在于，于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5227，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。

7.一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行：

(1)构建含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的穿梭质粒pUCaRBHV；

(2)构建含有目的基因序列的表达载体pMPTaRBHV；

(3)将步骤(2)的表达载体pMPTaRBHV用完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株；

其中所述汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(Hansenula)RB-11；所述含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株编号为RBHV145-6，已于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5227，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。

8.一种利用权利要求6所述的工程菌株进行医用水蛭素生产的方法，其特征在于，按照下 述步骤进行：

(1)利用含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6进行培养，选出高品质亚克隆细胞株，对菌株进行遗传性的全面鉴定，制成原始菌株；

(2)将部分原始菌株进行培养后冷冻保藏，作为日后生产使用的细胞种子库；

(3)将步骤(2)冷冻保藏的生产使用的菌株在转速为100rpm的条件下，37℃培养预发酵40h，然后将预发酵的发酵液接种到装有7.5L培养基的10L发酵罐中，设定pH为4±0.2，转速为500rpm，换气量为10L/min，温度为30℃；

(4)以甘油单碳源来控制生长分泌：在发酵开始的20～30h内，酵母生长的OD_600nm值达到40左右，氧分压下降到不到10％；接下来一直到发酵结束的过程中，pH为4±0.3，转速和换气量分别为700rpm和15L/min，设定氧分压为40％左右，根据发酵过程中氧分压的变化进行补料；

(5)待发酵结束后，采用扩张柱床阳离子交换层析和反相层析的方法进行产品的分离和纯化。

9.根据权利要求8所述的医用水蛭素的生产方法，其特征在于，所述步骤(4)中，接下来一直到发酵结束的过程为去阻遏过程，用时约为110-115h，最佳为112h。