[发明专利]一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞外型蛋白表达基因的真核汉逊酵母工程菌的构建，更具体地说，涉及一种含有水蛭素基因的工程菌株及其构建、生产水蛭素的方法。 

背景技术

水蛭在我国中医已有几千年的使用历史，是一种不可缺少的活血中药。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的具有强抗凝活性的小分子蛋白质，主要为一种含65个氨基酸的多肽，分子量在7000左右，含3个二硫键，已分离鉴定7种异构体。水蛭素因为具有与凝血酶极强的亲和力，在很低的浓度下就能中和凝血酶，起到抗凝作用，可广泛应用于器官移植等手术。水蛭素具有的溶纤作用使其具有较强的溶栓作用，能够抑制各种动物实验中的DIC(弥漫性血管内凝血)的形成。通过家兔试验证实水蛭素对预防和治疗动脉粥样硬化具有潜在的应用价值。此外水蛭素对促进脑血肿吸收，减轻周围脑组织炎症反应及水肿，缓解颅内压增高，并改善出血水肿局部血液循环，保护脑组织免遭破坏以及抑制肿瘤细胞的生长都有显著作用。 

利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。在实现体外表达蛋白质的过程中，努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构和生物学活性与天然蛋白一致是很重要的。酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达具有一定功能的外源蛋白质。具有表达系统操作简便，成本低廉，可大规模进行发酵等优点，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。中国专利申请“一种重组水蛭素编码基因与应用”(申请号200810103154.8，申请日2008年3月31日，公开日2008年8月27日)公开了一种利用多形汉逊酵母进行水蛭素的生产，但是其外源蛋白的表达量和分泌效率较低，且会产生过度糖基化现象，因而在适应于大规模发酵生产方面存在严重不足。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含有医用水蛭素基因的重组真核 汉逊酵母工程菌株及其构建方法。 

本发明的目的还在于提供一种利用上述重组工程菌株生产水蛭素的生产方法。 

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现： 

本发明提供的一种重组医用水蛭素编码基因，其序列是序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；其编码的多肽，其特征是具有序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。 

本发明提供一种重组水蛭素编码基因的重组表达载体，其为如附图2所示的表达载体pMPTaRBHV。 

本专利提供的一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5227，保藏日期为2011年9月7日，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。细胞为球形和伸长的球形(1.5-4.6)×(1.9-5.3)μm，以单个、成对或成群的方式出现。生长的菌落为奶油样tannish白。在同化培养基表面生长：偶而产生非常薄的膜。在生态琼脂Dalmau板25℃培养七天后在盖玻片下可探测出菌丝和假菌丝。 

所述水蛭素真核汉逊酵母工程菌的出发菌株为汉逊多型宿主细胞株RB-11(直接购自德国莱茵生物公司)。RB-11细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp.R et al.，1986 Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integration vectors，Mol.Gen Genet 202：302-308)。RB-11细胞株为5′-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。 

所述重组表达载体导入汉逊多型宿主细胞株(如RB-11)中可获得含有重组水蛭素编码基因的重组菌，其外源蛋白表达为[Ile¹，Thr²]-63位脱硫基水蛭素。 

本发明公开了水蛭素真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行： 

(1)构建含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的穿梭质粒pUCaRBHV； 

(2)构建含有目的基因序列的表达载体pMPTaRBHV； 

(3)将步骤(2)的表达载体pMPTaRBHV用完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株。