[发明专利]用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的引物、探针及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物，对人体来说有很大的危险性。

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic Choriomeningitis Virus，LCMV)属于嵌沙洋病毒科(Arenavirus)，为双义单链RNA病毒。有囊膜，病毒粒子近圆形，直径80～300nm之间，病毒粒子内部含有数量不等，大小在20～25nm的致密颗粒，形似嵌入沙粒。

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒可引起的人和许多种动物的人畜共患病——淋巴细胞性脉络丛脑膜炎。小鼠LCMV感染后的临床症状可表现为三种类型：内脏型、大脑型和迟发型。内脏型LCM小鼠表现被毛粗乱、结膜炎，有时出现腹水。大脑型LCM由脑内及神经途径感染而产生，病鼠表现为脑内接种后5～6天，有的小鼠突然死亡，其它小鼠表现被毛粗乱、懒动、嗜睡、消瘦，常见结膜炎和面部水肿。倒提时小鼠头部震颤，肢体痉挛，后肢强直性伸展。小鼠于出现上述症状后1～3天死亡。迟发型LCM常发生于子宫内感染和出生后1～2天感染的小鼠，病毒在体内增殖，但无症状，直到九个月后，可见病鼠体重减轻、被毛粗乱、蛋白尿、腹水、弓背等症状。

人类感染LCMV后，表现为流感样疾病，患者感染后1～2周，出现恶心、厌食、发烧等症状，在恢复期10％患者可出现腮腺炎和睾丸炎。还可引起无菌性脑膜炎、脑膜脑脊髓炎，表现为双侧乳头水肿、精神错乱、四肢麻痹、颈部强直、厌食、头痛等症状。

为了客观评价小鼠生物制品的质量，确保人民健康必将起到积极的作用，药典制定了鼠源病毒检测的标准。其中规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。

发明内容